论文部分内容阅读
目的:铁死亡是近年发现的一种新型的程序性细胞死亡方式,与坏死与凋亡不同。基于此的肿瘤新治疗模式研究层出不穷。但在铁死亡过程中,应激引起的热休克蛋白扮演着保护肿瘤细胞抵抗铁死亡的角色。本论文探究了热休克蛋白70家族抑制剂苯乙炔基磺酰胺(Pifithrin-μ,PFT)和铁死亡诱导剂爱拉斯汀(Erastin)对于诱导胶质瘤中铁死亡的协同增敏效应,并围绕以此构建基于聚多巴胺的肿瘤诊疗一体化探针及其应用展开了系统性研究。方法:使用CCK-8法和荧光染色法检测铁死亡诱导剂Erastin对于胶质瘤细胞的影响;使用CCK-8法、丙二醛含量检测法、还原型谷胱甘肽含量检测法和联合指数计算探究PFT联合Erastin对细胞铁死亡的影响;通过Western blot实验检测相关热休克蛋白和铁死亡指标谷胱甘肽过氧化物酶4(GXP4)在联合用药后的表达水平变化;通过敲除和过表达热休克蛋白HSPA5探究HSPA5在联合用药效应中的作用;构建裸鼠模型,进行联合用药评估治疗效果;通过多巴胺自聚成球的方法制备黑色素纳米球,装载PFT和Erastin构成PDA/PE;通过动态光散射仪(DLS)检测PDA/PE的尺寸、Zata电位和体外稳定性;使用高效液相色谱法(HPLC)检测PDA/PE中PFT和Erastin的装载率和体外释放率;使用激光共聚焦显微镜(CLSM)检测肿瘤细胞对PDA/PE的摄取率;使用CCK-8法检测PDA/PEG的生物相容性以及PDA/PE的细胞毒性;通过Western blot法检测PDA/PE对铁死亡相关指标的影响;通过构建裸鼠模型,尾静脉注射PDA/PE,进行肿瘤核磁成像定位和治疗效果评估。结果:CCK-8法和荧光染色法结果表明在胶质瘤细胞SW1783、U87MG和LN229中,Erastin均可引起铁死亡,且不同细胞对于Erastin的耐受能力不同;PFT联合Erastin用药与单独用药相比,细胞活性显著降低,丙二醛含量显著增加,还原型谷胱甘肽含量显著减少,HSPA5和GXP4的蛋白水平显著降低,加入铁死亡特异性挽救剂后有效地逆转了细胞死亡;敲除HSPA5后的胶质瘤细胞与空载对照细胞相比,经Erastin处理后细胞活性进一步降低了,GPX4表达进一步降低;过表达HSPA5的细胞与空载对照细胞相比,经Erastin处理后细胞活性得到挽救,GPX4表达也相对升高,经PFT联合Erastin处理后,增敏的细胞死亡也得到挽救;动物实验证实联合治疗对于抑制肿瘤生长相比单独药物处理效果更显著。成功制备纳米材料PDA/PE,DLS检测得到材料平均尺寸81.7 nm,Zeta电位-29.2±1.1 mV、体外稳定性良好;HPLC检测得PFT和Erastin的载药率分别为16%和9%,72 h释放量分别为63%及79%;CLSM检测得细胞对PDA/PE有良好的摄取;PDA/PE在低浓度即可引起细胞杀伤,以及导致GPX4表达降低;体内实验显示PDA/PE在磁共振检测下能够实现肿瘤定位显像,并且有效抑制肿瘤再生长。结论:本课题证明了Erastin能够诱导胶质瘤发生铁死亡,热休克蛋白HSPA5在其中起着负向调控铁死亡的作用。从而筛选出一种小分子化合物PFT,实验证明PFT能构通过HSPA5-GPX4轴增敏Erastin诱导的铁死亡。并且成功制备一种新型纳米材料,此药物以聚多巴胺为载体同时装载PFT和Erastin,能够实现肿瘤定位成像和诱导铁死亡治疗肿瘤,为癌症治疗提供新的策略。