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禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV),又称火鸡鼻气管炎病毒(Turkey rhinotracheitis virus, TRTV),早期称为禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV),该病毒最早于1978年从南非发病火鸡中分离得到,之后在世界范围内蔓延传播。aMPV是副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属成员,有囊膜,属单节段负链RNA病毒。病毒mRNA的加工处理对病毒基因的表达与病毒基因组的复制至关重要,mRNA的加工处理过程包括加帽、甲基化和聚腺苷酸化。其中加帽和甲基化对mRNA的稳定、翻译及基因表达最为重要,这些加工过程需要一系列的酶促反应,AMPV复制过程中的上述一系列酶促反应均由其L蛋白负责完成。对于单股负链R.NA病毒而言,其L蛋白包括六个高度保守的功能域,分别为CRⅠ、CRⅡ、CRⅢ、 CRIV、 CRV和CRVI功能域。单股负链RNA病毒具有独特的mRNA甲基化机制。生物信息学分析显示,aMPV L蛋白CRVI功能域具有guanine-N-7 (G-N-7)和ribose2’-O(2’-O)甲基转移酶催化活性,这两个甲基转移酶活性位点共用一个甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点。基于生物信息学分析,我们对aMPV L蛋白CRVI功能域预测的MTase催化位点及S-腺苷甲硫氨酸结合位点进行氨基酸定点突变,并运用反向遗传学系统,成功拯救了raMPV-G1696A、raMPV-G1700A、raMPV-N1701A和raMPV-D1755A四株aMPV科罗拉多株(Colorado)重组病毒。体外甲基化研究结果显示,四株重组病毒在2’-0位点的甲基化有明显的消减,但在G-N-7位点的甲基化却几乎未受影响。另外,进一步的两步甲基化试验证明G-N-7位点的甲基化先于2’-O位点的甲基化且前者对后者有促进作用。重组病毒蚀斑试验和生长特性分析表明,四株重组病毒在细胞上培养时高度致弱,且保持着良好的遗传稳定性。为进一步验证aMPV甲基转移酶缺陷株是否可以作为弱毒疫苗进行开发,本研究开展了重组病毒的动物试验研究。通过点眼、滴鼻途径将5×106PFU的重组病毒接种2周龄火鸡,研究重组病毒在火鸡内的致病性和免疫原性。结果显示,四株甲基缺陷性重组病毒在火鸡呼吸道内的复制能力均降低,并且可以诱发高水平的中和抗体,可以完全保护火鸡免受同源性野生型aMPV科罗拉多株(aMPV/CO)和异源性野生型aMPV明尼苏达株(aMPV/MN)的攻毒感染。总之,体外试验显示,缺少2’-O位点甲基化的重组禽偏肺病毒(raMPV),高度致弱且保持着良好的遗传稳定性,动物试验表明,raMPV对天然宿主火鸡具有很好的免疫原性。因此甲基转移酶缺陷型重组病毒可作为aMPV理想的疫苗候选株。此外,甲基化位点突变使raMPV致弱的策略可望用于其它禽类和人类副粘病毒疫苗的研制开发。