宫颈癌是危害女性健康的重要疾病之一,流行病学调查研究表示,近年来呈现逐年增加、发病年轻化的趋势。由于筛查宫颈癌的工作不完善,我国的发病率仍是发达国家的6倍,80%确诊时已是浸润癌。手术是目前早期宫颈癌最主要的治疗手段,然而仍有10%-15%的患者出现复发和转移。如何筛选出有复发和转移高危因素的患者,并采取个体化的综合治疗以提高生存率和生活质量,是妇科肿瘤领域值得探讨的课题。因而,寻找有效的方法抑制肿瘤的侵袭及转移至关重要。目前,国内外学者普遍认为:肿瘤的发生、发展、浸润、转移是一种多因素共同参与的复杂过程。uPA/uPAR系统在肿瘤的生长、侵袭、转移中起着重要作用,血液中的suPAR可能是体内反映uPA系统活性的更方便、更可靠的有效指标。本研究进一步探讨uPAR与宫颈癌细胞侵袭、转移及血管形成的关系,以期寻找癌转移更有效的分子生物学指标;进一步探讨suPAR早期诊断的临床作用和意义;并通过携带suPAR基因的质粒pcDNA3.1-suPAR转染宫颈癌Hela细胞及裸鼠皮下移植瘤的构建过程中,深入研究suPAR基因对宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,进一步阐明suPAR基因表达与宫颈癌侵袭、转移的分子生物学变化,探讨suPAR靶向基因治疗在抗肿瘤治疗中的价值,为肿瘤的靶点治疗寻找新的途径。第一部分uPAR、VEGF-C在宫颈鳞状细胞癌的表达及临床意义目的:本部分通过检测uPAR、VEGF-C在宫颈鳞状细胞癌组织中的免疫组化表达情况,分析与宫颈癌细胞侵袭、转移及血管形成的关系,以期寻找癌转移更敏感的分子生物学指标。方法:本研究通过回顾性分析40例Ⅰ-Ⅱ期宫颈癌患者的临床资料,免疫组化方法检测uPAR和VEGF-C在宫颈鳞状细胞癌中的表达,以进一步探讨uPAR和VEGF-C在宫颈鳞状细胞癌中的浸润、转移作用,为判断宫颈癌的预后和正确选择治疗方案提供新的依据。结果:1 uPAR、VEGF-C宫颈鳞癌组织的免疫组化表达结果uPAR在Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织阳性表达率均85%,VEGF-C在Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织阳性表达率分别为80%、90%。uPAR、VEGF-C在Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织的表达明显高于CIN及正常组织(P<0.05),而Ⅰ和Ⅱ期宫颈癌组织之间无显著性差异(P>0.05)。uPAR和VEGF-C的表达在宫颈癌各级分化中,G1与G2,G1与G3均有显著性差异(P<0.05),而G2和G3无显著性差异(P>0.05)。2 uPAR、VEGF-C在宫颈鳞癌复发、转移的随访结果40例患者至随访终止时,uPAR阳性表达34例中23例复发,复发率57.50% (23/40),11例局部复发27.50% (11/40),3例远处转移7.50% (3/40),9例死亡22.50% (9/40),死于宫颈癌;VEGF-C阳性34例17例复发,复发率42.50%(17/40),7例局部复发17.50% (7/40),1例远处转移2.50% (1/40),9例死亡22.50% (9/40),两组间复发率、转移率、死亡率无统计学意义(P>0.05),但两组相关性分析(r=0.998,P=0.000<0.05),有显著相关。结论:1宫颈鳞癌患者癌组织uPAR、VEGF-C呈异常高表达,且随着级别的增加而增高,表明了uPAR、VEGF-C在宫颈癌侵袭、转移的过程中发挥着重要的作用;2高表达的uPAR、VEGF-C提示宫颈癌的侵袭、转移性更强,预后较差;3 uPAR、VEGF-C的检测对于早期宫颈鳞癌有实际临床意义,有助于更准确的评估患者的预后及指导治疗。第二部分suPAR在宫颈癌血浆的定量检测及早期诊断的意义目的:检测正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌及晚期癌放化疗前后血浆suPAR水平,以进一步探讨suPAR、SccAg在宫颈癌发生发展中的作用和早期诊断的临床意义。方法:采用ELISA方法测定60例宫颈鳞癌患者血浆中suPAR、SccAg值,以38例健康妇女的正常宫颈做对照。测定suPAR、SccAg在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌及晚期癌放化疗前后中的水平,比较、分析。结果:1健康妇女血浆suPAR含量水平的测定结果38例健康妇女血浆suPAR水平为0.8967±0.0411log10(ng/ml),参考值范围:0.8297~0.9581 log10(ng/ml),不同年龄对照组的suPAR水平的关系。提示对照组妇女各年龄之间suPAR水平比较,差别无统计学意义(P=0.969>0.05)。2宫颈癌及CIN患者血浆suPAR含量的测定结果各期宫颈癌及CIN患者的血浆suPAR含量比对照组明显升高,均有统计学意义(P<0.01);SNK-q两两比较得出:Ⅰa~Ⅱa宫颈癌患者较癌前病变患者血浆suPAR升高,Ⅱb~Ⅳ宫颈癌患者较癌前病变及Ⅰa ~Ⅱa的患者suPAR水平均升高,均有统计学意义(P值均<0.05);显示宫颈癌患者血浆suPAR含量与分期有关,其期别越高血浆suPAR含量越高。3宫颈癌患者Ⅱb ~Ⅳ放化疗前后血浆suPAR含量的测定结果Ⅱb ~Ⅳ期宫颈癌患者放化疗后血浆suPAR含量较放化疗前明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。4 suPAR、SccAg在宫颈癌患者血浆中含量测定值的结果比较suPAR在宫颈癌患者血浆中的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为98.43%、66.67%、91.30%、92.30%,SccAg的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为57.81%、94.44%、97.40%、38.60%。ROC曲线下面积suPAR为0.858,标准误0.064,可信区间(0.733,0.983)。SccAg为0.805,标准误0.050,可信区间(0.707,0.904)。suPAR优于SccAg。结论:1血浆suPAR随着宫颈癌分化程度、临床期别的增加而升高,suPAR与其有明显相关。2 suPAR的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为98.43%、66.67%、91.30%、92.30%,SccAg的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为57.81%、94.44%、97.40%、38.60%。suPAR诊断准确率高。可做为宫颈癌早期诊断、监测病情进展、判断预后的有价值指标。第三部分稳定转染supAR基因的宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的构建及其基因靶向治疗机制的研究目的:通过构建携带suPAR基因的质粒pcDNA-suPAR转染宫颈癌Hela细胞及裸鼠皮下移植瘤的构建过程中,深入研究suPAR基因转染对宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的作用,进一步阐明suPAR基因表达与宫颈癌侵袭、转移的分子生物学变化,为宫颈癌的有效靶点治疗提供理论依据。方法:本部分研究对suPAR基因的转录调控进行了以下研究:通过用RT-PCR的方法从人肝癌细胞株HepG2中克隆到全长为849bp的suPAR基因片段,ELISA法检测suPAR基因的表达水平与细胞的侵袭转移能力存在正相关;真核表达载体pc-suPAR的构建与酶切鉴定;用ELISA法检测suPAR在真核细胞Hela中的有效表达;稳定转染suPAR基因的Hela细胞;肿瘤接种于裸鼠,观察肿瘤的生长曲线。通过研究suPAR基因在转录水平的调控机制,分析该基因的转录调控与细胞侵袭、转移的关系。结果:1 suPAR基因的获得用RT-PCR的方法成功地从人肝癌细胞株HepG2中克隆到全长为849bp的suPAR基因片段。2携带suPAR基因的真核表达载体的获得2.1 psuPAR酶切鉴定suPAR基因的RT-PCR产物与质粒pcDNA3.1/V5-His用EocRI和XbaI双酶切割后,经Ligation连接,转化TOPO10受体菌,然后用上述双酶酶切鉴定,电泳结果可见在大约849bp和5500bp处出现2条带,与预期结果相同。2.2 psuPAR测序鉴定将重组载体psuPAR进行测序,结果也显示,重组表达载体psuPAR携带的suPAR核苷酸序列及其编码的氨基酸序列也与GeneBank人suPAR基因序列(1-849bp )完全一致。3 suPAR在真核细胞Hela中的有效表达为检测suPAR在真核细胞的表达情况,将psuPAR转染Hela细胞,72 h后,收集转染细胞上清经ELISA方法检测suPAR表达。转染质粒psuPAR后,Hela细胞培养上清中suPAR的表达明显高于未转染的Hela细胞(p<0.05),说明psuPAR质粒可在Hela细胞中良好表达。4稳定转染supAR基因的Hela细胞的获得将suPAR基因插入含有新霉素(neo)抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1-V5/His,得到重组表达质粒pcsuPAR。将该表达质粒转染Hela细胞,经G418(800μg/ml)完全培养基进行加压筛选,得到阳性克隆。并改用浓度为400μg/ml的G418维持。稳定表达suPAR基因的Hela细胞克隆,用ELISA方法进行鉴定。将ELISA测得的各个克隆的OD值按照标准曲线y=0.197x-0.291换算出各个克隆ng/ml值。5 suPAR基因对荷宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的体内生长抑制作用结果将稳定表达suPAR基因的Hela细胞与野生型Hela细胞分别皮下移植到裸鼠,发现野生型Hela宫颈癌裸鼠移植瘤在第10d可明显触摸到肿瘤块,而稳定转染suPAR的宫颈癌裸鼠移植瘤则生长缓慢。在荷宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的第30d,处死小鼠,剥离肿瘤块称重,结果显示Hela/ pcDNA3.1-suPAR组重量明显低于Hela组(P<0.01)。Hela/ pcDNA3.1- suPAR组比Hela组石蜡HE切片显示核固缩、核浓染、核分裂明显减少。结论:1 suPAR基因的表达水平与肿瘤的侵袭转移能力密切相关,高水平预示着肿瘤的侵袭转移能力强,预后差;2成功获得suPAR基因;3成功获得携带suPAR基因的真核表达载体;4成功获得稳定转染suPAR基因的Hela细胞株(pcDNA3.1-suPAR);5成功获得pcDNA3.1-suPAR转移至宫颈癌裸鼠移植瘤动物模型;6 pcDNA3.1-suPAR基因裸鼠移植瘤接种显示suPAR基因有明显抑瘤作用,表明suPAR基因是基因靶向治疗宫颈癌的有效靶点。