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目的:LXR-623是一种肝X受体(LXR)激动剂,可减缓动脉粥样硬化斑块的进展且已应用于临床试验中。近年来,LXR-623由于其显著抑制恶性胶质瘤细胞的生长而受到广泛关注,但其对其他癌细胞增殖的作用及其机制仍然未知。而长链非编码RNA(lncRNA)作为新型肿瘤分子靶点,参与癌症发生发展和多种生物过程的关键调节。因此,本课题探讨LXR-623能否通过lncRNA分子作为药物的新型靶点及下游信号通路,介导抑制乳腺癌细胞增殖以及抑制异种移植瘤模型中瘤体生长,为LXR激动剂可应用于乳腺癌治疗相关措施及其机制提供新思路。方法:本研究分为两部分:1.LXR-623抑制乳腺癌细胞的增殖(1)LXR-623对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响1)CCK8检测以DMSO为药物空白对照,对不同浓度(1、2.5、5μmol/l)、不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623对乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549、MCF7、MDA-MB-453,对照于正常乳腺上皮细胞MCF10A的抑制增殖的效果。2)流式凋亡检测、周期检测及克隆形成实验测试不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623(5μmol/l)对乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549的凋亡影响。3)Western blot检测不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623(5μmol/l)在乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549中,分别对凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3、Bax、BCL2和细胞周期相关蛋白:cyclin E1、CDK2、cyclin A2的表达情况。(2)LXR-623对异种移植瘤生长的影响1)LXR-623口服喂养被接种MDA-MB-231细胞移植瘤的雌性裸鼠,观测LXR-623对移植瘤生长的影响。2.LXR-623抑制乳腺癌细胞增殖的药效靶点及下游通路机制(1)lncRNA芯片探究LXR-623的药效靶点,及筛选得到的靶点lncRNA分子在乳腺癌中的功能表型1)lncRNA芯片探寻L XR-623处理后的MDA-MB-231细胞里有表达差异的lncRNA分子。2)筛选得到的lncRNA分子--LINC01125,用qPCR检测LINC01125在乳腺癌病人肿瘤中的表达情况、乳腺癌细胞系里的表达情况及FISH检测LINC01125在乳腺癌细胞里的定位情况。3)CCK8、流式细胞术分别检测Vector组、过表达LINC01125组、过表达LINC01125+LXR-623组和si-NC组、si-LINC01125组、si-LINC01125++LXR-623组的增殖、凋亡情况。4)Western blot检测Vector组、过表达LINC01125组、过表达LINC01125+LXR-623组和si-NC组、si-LINC01125组、si-LINC01125++LXR-623组的凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3、Bax、BCL2和细胞周期相关蛋白:cyclin E1、CDK2、cyclin A2的蛋白表达情况。(2)LXR-623的下游通路机制1)Western blot检测LXR-623在MDA-MB-231、BT-549两个细胞系中通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达情况。2)加入PTEN特异性抑制剂SF1670后,CCK8、流式细胞术检测DMSO组、LXR-623+SF1670组、LXR-623组的增殖、凋亡情况。3)Western blot检测SF1670组、LXR-623+SF1670组、LXR-623组的凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3、Bax、BCL2的表达情况。(3)LINC01125与PTEN/AKT/p53通路的调节关系1)Western blot检测non-transfaction组、Vector组、过表达LINC01125组和non-transfaction组、si-NC组、si-LINC01125组中通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达情况。2)加入PTEN特异性抑制剂SF1670后,CCK8、流式细胞术检测Vector+SF1670组、过表达LINC01125+SF1670组、过表达LINC01125组的增殖、凋亡情况。3)Western blot检测Vector+SF1670组、过表达LINC01125+SF1670组、过表达LINC01125组中通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达情况。4)生物信息学预测LINC01125与p53的直接调控关系。结果:1.LXR-623在体内、体外抑制乳腺癌的增殖与凋亡(1)LXR-623对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响1)CCK8检测以DMSO为药物空白对照,对不同浓度(1、2.5、5μmol/l)、不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623对乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549、MCF7、MDA-MB-453,对照于正常乳腺上皮细胞MCF10A,结果显示:LXR-623对乳腺癌细胞系均有随浓度梯度、时间梯度的抑制细胞增殖的效果。(P<0.05)。2)流式凋亡检测、周期检测及克隆形成实验测试不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623(5μmol/l)对乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549的结果显示:随着LXR-623处理时间的增长,不仅对乳腺癌细胞的凋亡有促进作用,周期检测也说明LXR-623将细胞周期阻断在S期。(P<0.05)3)Western blot检测不同处理时间(24、48、72h)的LXR-623(5μmol/l)在乳腺癌细胞系:MDA-MB-231、BT-549中,分别检测到凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3表达增加、Bax表达增加、BCL2表达降低和细胞周期相关蛋白:cyclin E1表达增加、CDK2表达增加、cyclin A2表达降低。(P<0.05)(2)LXR-623对异种移植瘤生长的影响1)被接种MDA-MB-231细胞移植瘤的雌性裸鼠分成两组:空白对照组和LXR-623处理组,每日50㎎/㎏口服喂养,每两日查看肿瘤大小,10天后取下瘤子,观测到LXR-623对移植瘤生长有明显的抑制效应。2.LXR-623抑制乳腺癌细胞增殖的药效靶点及下游通路机制(1)lnc RNA芯片探究LXR-623的药效靶点,及筛选得出的靶点lnc RNA分子在乳腺癌中的功能表型1)lnc RNA芯片探寻LXR-623处理后的MDA-MB-231细胞里有表达差异的lnc RNA分子中:433个lnc RNA上调,510个lnc RNA下调。2)筛选得到的lnc RNA分子--LINC01125,q PCR检测LINC01125在乳腺癌病人肿瘤中低表达、乳腺癌细胞系里低表达及FISH检测LINC01125在乳腺癌细胞里主要定位于胞质。3)CCK8、流式细胞术分别检测Vector组、过表达LINC01125组、过表达LINC01125+LXR-623组和si-NC组、si-LINC01125组、si-LINC01125++LXR-623组的结果显示:敲低LINC01125后促进细胞增殖,过表达LINC01125后促进细胞凋亡,而LXR-623的药效靶点Rescue实验显示敲低LINC01125后加入LXR-623,LXR-623效果明显被抑制,而过表达LINC01125后LXR-623效果被增大。4)Western blot检测Vector组、过表达LINC01125组、过表达LINC01125+LXR-623组和si-NC组、si-LINC01125组、si-LINC01125++LXR-623组的凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3、Bax、BCL2和细胞周期相关蛋白:cyclin E1、CDK2、cyclin A2的蛋白表达情况,结果显示:LXR-623诱导的增加的Cleaved caspase-3和Bax的表达、降低的BCL2表达,这种效应可以通过LINC01125的过度表达而加强,也可以通过LINC01125的击倒来部分阻断。LXR-623诱导的cyclin E1、CDK2表达上调和cyclin A2表达下调可通过敲除LINC01125而减弱,也可通过上调LINC01125表达而放大。(2)LXR-623的下游通路机制1)Western blot检测LXR-623在MDA-MB-231、BT-549两个细胞系中不同的处理时间(24、48、72h),对通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达影响结果:PTEN、p53表达增加,p-AKT、p-MDM2表达降低,AKT、MDM2表达无明显差异。2)加入PTEN特异性抑制剂SF1670后,CCK8、流式细胞术检测DMSO组、LXR-623+SF1670组、LXR-623组的增殖、凋亡情况,结果显示:在均加入LXR-623处理之后,再加入SF1670后能部分逆转LXR-623的效应,凋亡效果被削弱。3)Western blot检测SF1670组、LXR-623+SF1670组、LXR-623组的凋亡相关蛋白:Cleaved caspase3、Bax、BCL2的表达情况,分析显示:在SF1670处理浓度(3μmol/l)没检测出对细胞有任何凋亡效应影响下,LXR-623+SF1670组的Cleaved caspase3、Bax表达低于LXR-623组,而其BCL2的表达高于LXR-623组。(3)LINC01125与PTEN/AKT/p53通路的调节关系1)Western blot检测non-transfaction组、Vector组、过表达LINC01125组和non-transfaction组、si-NC组、si-LINC01125组中通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达情况,结果显示:过表达LINC01125组相较于对照组,PTEN、p53表达增加,p-AKT、p-MDM2表达降低,AKT、MDM2表达无明显差异。si-LINC01125组相较于对照组,PTEN、p53表达降低,p-AKT、p-MDM2表达增加,AKT、MDM2表达无明显差异。2)加入PTEN特异性抑制剂SF1670后,CCK8、流式细胞术检测Vector+SF1670组、过表达LINC01125+SF1670组、过表达LINC01125组的增殖、凋亡情况:相较于对照Vector+SF1670组,过表达LINC01125+SF1670组的凋亡率明显低于过表达LINC01125组。3)Western blot检测Vector+SF1670组、过表达LINC01125+SF1670组、过表达LINC01125组中通路分子:PTEN、AKT、p-AKT、MDM2、p-MDM2、p53的表达情况:过表达LINC01125+SF1670组中部分逆转了原本在过表达LINC01125组中高表达的PTEN、p53和低表达的p-AKT、p-MDM2。4)生物信息学预测LINC01125与p53的启动子直接结合,经过Ch IP验证,在乳腺癌细胞系中,相较于对照组,LINC01125与p53结合度明显增高。结论:LXR-623能通过药效靶点LINC01125及下游通路PTEN/AKT/MDM2/p53信号轴,介导对乳腺癌细胞的抑制增殖的效应。因此,LXR-623有可能成为辅助乳腺癌治疗的新靶点,而且证明lnc RNA在癌症的发生发展甚至是各种生物学反应均能起到关键效应。