胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是巴氏杆菌科中重要的病原菌,它引起猪的一种高度接触性传染呼吸道疾病—猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagious pleuropneumonia,PCP）。该病分布广泛,难以根除,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,预防和控制该疾病尤其重要。然而APP血清型众多（目前已经发现有15种血清型）,并且不同血清型之间的交叉保护力较低,对该病的预防控制和治疗带来了极大的困难。而且许多国家用大量不同的抗生素来预防和治疗猪传染性胸膜肺炎,致使许多病原菌（包括APP）产生了极强的抗药性,这对该病的预防和治疗更是雪上加霜。现阶段,为了解决APP的预防和治疗问题,需要对APP的毒力因子、毒力相关因子以及膜蛋白和鞭毛等进行分子生物学研究。但研究这些基因和相关因子的前提是要具备相应的遗传操作工具,如穿梭载体,高效的突变体构建平台等,为技术支持。本文主要对APP的遗传操作工具的研究,包括以下两个方面内容:1.胸膜肺炎放线杆菌内生质粒pHB0503分析质粒pHB0503分离于2005年的胸膜肺炎放线杆菌地方分离菌株HB0503。大小为15.079kb,含有16个ORF,其中7个是抗性基因（sul2,catA3,aacC2,strA,strB’,blaROB-1和aph（3）-I）。对这些抗性基因簇序列的生物信息分析,来研究该抗生素簇的进化和结构组成。实验数据分析表明该质粒可能在来源不同的质粒间,发生了同源重组而形成的。另外,RT-PCR实验证明:两处抗性基因簇的共转录,分别从sul2和bla_ROB-1启动子开始地。对该质粒的复制蛋白的分析,有可能在此基础上构建在APP中能稳定复制地穿梭载体和遗传操作系统,为进一步从分子生物学水平研究胸膜肺炎放线杆菌提供技术支持。而且对内生质粒抗性基因的研究,对临床抗生素的使用也有指导意义。2.胸膜肺炎放线杆菌温敏复制型质粒的构建PCR定向突变系统是新型的高效遗传操作体系,已经广泛应用于微生物学研究。构建该系统至少需要重组酶系统、抗性基因PCR模版、诱导型启动子、温敏复制型质粒等四大要件。本实验室已经拥有前三大要件,缺乏APP的温敏复制型质粒。为了构建一个APP的温敏复制型质粒,本研究以APP-E.coli穿梭质粒pJN105和pR318为出发质粒,采用低保真度PCR基因扩增和修复系统缺陷型E.coli感受态细胞基因克隆两种途径筛选温敏复制元件,为构建温敏复制载体奠定基础。