既往认为T辅助细胞分为Th1(T help cell 1)和Th2(T help cell 2)型,最近研究发现初始T辅助细胞(naive CD4+T cell,Th0)至少可以分化为4种亚群,除Th1和Th2外,还有调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和Th17(IL-17 producing T cell)细胞。Th0细胞在抗原呈递细胞分泌的TGF-β作用下可分化为调节性T细胞(Treg),若同时存在TGF-β和IL-6则Th0分化为Th17细胞。Foxp3 (foxhead box protein 3)和RORγt (orphan nuclear receptor)分别是控制Th0向Treg和Th17分化的关键性转录因子。Th17细胞能够介导前炎症反应,与自身免疫性疾病关系密切。调节性T细胞在阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要作用。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性侵蚀性周围关节炎为主要表现的自身免疫性疾病,病因及发病机制尚不完全清楚。胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠是目前公认的研究RA较为理想的动物模型。越来越多的研究表明Th17细胞和CD4+ Treg细胞在RA发病中占有重要地位。各种免疫活性细胞参与RA发病,病程中细胞因子网络失衡并产生大量炎症介质,其中花生四烯酸代谢产物前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是相当重要的致炎因子。动物实验表明阻断PGE2受体或敲除PGE2受体的CIA小鼠病情明显缓解。PGE2的受体(EP1-4)分布广泛,研究认为PGE2具有明确的免疫调节作用。但其调控Th1/Th2平衡的作用存在争议,认为PGE2既有促炎作用又有抗炎活性,多数研究表明PGE2抑制Th0向Th1分化而促进其向Th2方向分化。但PGE2对Treg和Th17分化的影响鲜有报道。基于上述研究我们认为炎症介质PGE2可能对Treg/Th17细胞的分化具有调控作用,并可能通过此调节作用参与RA的发病过程。本课题在细胞水平以Th0作为靶细胞研究了PGE2对Treg和Th17细胞分化的影响及及其受体学机制,在整体水平应用PGE2受体阻断剂观察对CIA小鼠病情的影响探讨了PGE2是否可通过影响Treg和Th17细胞分化而参与RA发病,以进一步揭示炎症介质PGE2在RA发病中的免疫调节作用。1 PGE2受体在CD4+CD62L+ na?ve T (Th0)细胞的表达本部分研究应用MiniMACS系统,磁珠分选C57/BL6小鼠脾CD4+ CD62L+ (Th0)细胞流式细胞术鉴定纯度。分选后的细胞分别加入抗EP1、EP2、EP3和EP4的多克隆抗体和荧光二抗,流式细胞仪检测EP1-4在Th0的表达,RT-PCR技术检测EP1-4 mRNA在Th0的表达情况。结果显示:(1)细胞经磁珠分选后,经流式细胞术鉴定CD4+CD62L+细胞纯度在90%以上。(2)经流式细胞术检测,前列腺素E2的4个受体EP1、EP2、EP3、EP4在CD4+CD62L+ na?ve T细胞上均有不同程度的表达,其中EP2表达最强,EP4表达最弱。(3) RT-PCR技术检测到EP1、EP2、EP3、EP4 mRNA在CD4+CD62L+ na?ve T细胞上均有表达。该结果为进一步研究PGE2对Th0分化的调节作用提供了结构基础。2 PGE2对Th0向Treg和Th17细胞定向分化的调节作用及受体学途径本部分研究应用磁珠分选的Th0细胞,在抗CD3/CD28存在的条件下,TGF-β1作用72h后,应用流式细胞术检测,发现(28.65+6.83)%细胞同时表达CD25和Foxp3 (P<0.05);应用实时荧光定量RT-PCR技术检测转录因子Foxp3 mRNA的表达,发现在36h达到高峰,说明成功诱导了Treg细胞的产生。PGE2能剂量依赖性降低CD25+Foxp3+细胞数量,其中1μM PGE2作用最强(0.01, 0.1, 1μM三个剂量组均P<0.05),表明PGE2可明显抑制Th0细胞向Treg细胞分化的数量。诱导Th0向Treg细胞分化,加入EP1-4受体的特异性激动剂(浓度均为10μM),研究PGE2产生上述作用的受体途径,发现17-phenyl trinor PGE2 (EP1激动剂)、sulprostone (EP3激动剂)对CD25 + Foxp3 +细胞数量无明显影响(P>0.05) ,PGE1-alchol (EP4激动剂)部分模拟了PGE2降低CD25+Foxp3+细胞数量的作用(P<0.05),而butaprost (EP2激动剂)几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05)。诱导Th0向Treg细胞分化,加入不同剂量的PGE2,36h后应用荧光定量RT-PCR技术检测Foxp3 mRNA的表达,发现PGE2剂量依赖性抑制了Foxp3 mRNA的表达,其中1μM PGE2作用最强(0.01, 0.1, 1μM三个剂量组均P<0.05),表明PGE2在mRNA水平可抑制Th0细胞向Treg细胞分化。诱导Th0向Treg细胞分化,加入EP1-4受体的激动剂(浓度均为10μM,研究PGE2产生上述作用的受体途径,发现sulprostone对Foxp3 mRNA的表达无明显影响(P>0.05),17-phenyl trinor PGE2和PGE1-alchol部分模拟了PGE2抑制Foxp3 mRNA表达的作用(P<0.05),而butaprost几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05)。上述结果表明PGE2产生抑制Th0向Treg细胞方向分化的作用,该作用可能通过EP2和EP4受体途径介导。Th0细胞在抗CD3/CD28存在的条件下,TGFβ1和IL-6作用72h后应用ELISA法检测,发现IL-17含量明显升高,达到(677.89+87.73)ng/L (P<0.05);应用实时荧光定量RT-PCR技术检测转录因子RORγt mRNA的表达,发现在48h达到高峰,说明成功诱导了Th17细胞的产生。PGE2能剂量依赖性降低IL-17的含量,其中1μM PGE2作用最强(0.01, 0.1, 1μM三个剂量组均P<0.05),表明PGE2在蛋白水平可能抑制Th0细胞向Th17细胞分化(P<0.05)。诱导Th0向Th17细胞分化,加入EP1-4受体的激动剂(浓度均为10μM),研究PGE2产生上述作用的受体途径,发现17-phenyl trinor PGE2、sulprostone对IL-17分泌无明显影响(P>0.05), PGE1-alchol部分模拟了PGE2降低IL-17分泌的作用(P<0.05),而butaprost几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05)。诱导Th0向Th17细胞分化,加入不同剂量的PGE2,48h后应用荧光定量RT-PCR技术检测RORγt mRNA的表达,发现PGE2剂量依赖性抑制了RORγt mRNA的表达,其中1μM PGE2作用最强(0.01, 0.1, 1μM三个剂量组均P<0.05),表明PGE2在mRNA水平可抑制Th0细胞向Th17细胞分化(P<0.05)。诱导Th0向Treg细胞分化,加入EP1-4受体的激动剂(浓度均为10μM),研究PGE2产生上述作用的受体途径,发现sulprostone对RORγt mRNA的表达无明显影响(P>0.05),17-phenyl trinor PGE2和PGE1-alchol部分模拟了PGE2抑制RORγt mRNA表达的作用(P<0.05),而butaprost几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05)。上述结果表明PGE2可能抑制Th0向Th17细胞方向的分化,该作用可能通过EP2和EP4受体途径介导。3 PGE2对CIA小鼠Treg/Th17细胞的影响选用雌性DBA/1小鼠50只,随机分为空白对照组(6只)和CIA单纯造模组(12只),AH6809(EP2受体阻断剂)处理组(9只),L161982(EP4受体阻断剂)处理组(9只),DMF溶剂对照组(7只),DMSO溶剂对照组(7只)。适应环境3天后尾根部注射Ⅱ型胶原及完全弗氏佐剂的乳化剂100μl (含CⅡ200μg),d21后再次尾根部加强免疫。AH6809和L161982处理组分别给相应的药物,剂量均为5mg/Kg/d,从第二次CⅡ免疫后次日开始腹腔注射连续14天。溶剂对照组分别给予相应的溶剂DMF+PBS和DMSO+PBS,注射方式相同。造模28天时分离CIA造模组小鼠的脾细胞,裂解红细胞后制成单细胞悬液,1×106cell/孔种于24孔板,与CⅡ(50μg/ml)共同孵育,观察PGE2及其受体激动剂、阻断剂对Treg和Th17细胞的影响。首次免疫后第35天观察各组发病情况及关节病理改变,取各处理组脾及腹股沟引流淋巴结细胞流式细胞术以CD4+ T细胞开窗测定CD25+Foxp3+ Treg细胞占CD4+T细胞的比例,ELISA法测定血清IL-17含量观察AH6809和L161982对CIA小鼠病情和Treg/Th17平衡的影响。结果表明外源性PGE2能剂量依赖性降低造模28天分离的脾细胞CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞的比例,其中1μM PGE2作用最强(0.01, 0.1, 1μM三个剂量组均P<0.05)。17-phenyl trinor PGE2、sulprostone对CD25+Foxp3+细胞比例无明显影响(P>0.05),butaprost部分模拟了PGE2降低CD25+Foxp3+细胞比例的作用(P<0.05),AH6809未能拮抗外源性PGE2对CD25+Foxp3+细胞比例的影响。PGE1-alchol几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05),L161982对外源性PGE2降低CD25+Foxp3+细胞比例的作用产生了明显的拮抗作用。上述结果表明外源性PGE2抑制造模第28天CIA小鼠脾细胞CD4+ Treg细胞的分化,此作用可能通过EP2和EP4受体介导。另外,外源性PGE2能剂量依赖性减少造模28天分离的脾细胞IL-17分泌量,其中1μM PGE2作用明显(P<0.05)。17-phenyl trinor PGE2、sulprostone对IL-17分泌量无明显影响(P>0.05),butaprost部分模拟了PGE2降低IL-17分泌量的作用,但无明显统计学意义(P>0.05),AH6809未能拮抗外源性PGE2对IL-17含量的影响。而PGE1-alchol几乎完全模拟了PGE2的上述作用(P<0.05),L161982对外源性PGE2降低IL-17分泌量的作用产生了明显的拮抗作用。上述结果表明外源性PGE2可能抑制免疫第28天CIA小鼠脾细胞Th17细胞的分化,且此作用通过EP4介导。首次免疫后第27天CIA组小鼠踝关节及足趾开始出现肿胀,随着时间的延长出现踝关节、足趾肿痛及活动受限等典型改变,在造模第35天左右病情达到高峰,造模率可达到90%。造模第35天取踝关节和足趾关节进行组织病理学检测:CIA小鼠关节腔内有大量的炎性细胞浸润、滑膜增生形成血管翳,侵犯关节软骨和骨。首次免疫后第35天检测造模鼠脾和腹股沟引流淋巴结CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞的比例,发现腹股沟引流淋巴结CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞的比例较脾明显升高(P<0.05),造模组小鼠脾和腹股沟引流淋巴结CD25+Foxp3+细胞比例均较空白对照组明显减少(P<0.05),表明CIA小鼠CD4+调节性T细胞数量较正常鼠明显减少。首次免疫后第35天测定CIA小鼠血清,发现造模组小鼠血清IL-17含量较空白对照组明显增高(P<0.05),表明CIA小鼠Th17细胞可能较正常鼠明显增多。AH6809和L161982对CIA疾病开始时间无明显影响,各组均在第27-28天开始发病,发病率各组之间无明显差异。造模组关节评分和溶剂对照DMF、DMSO组无明显差异,AH6809组关节评分较造模组略低,但无明显统计学差异(P>0.05),而L161982组关节评分较造模组明显降低(P<0.05)。AH6809组关节组织病理与造模组无明显差异,而L161982组在关节腔内炎性细胞浸润、滑膜增生及关节软骨和骨侵犯的组织病理评分上较造模组明显减轻(P<0.05)。上述结果表明EP4受体阻断剂明显减轻了CIA小鼠的病情,而EP2受体阻断剂对CIA病情无明显影响。造模组小鼠脾和腹股沟引流淋巴结CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞比例与溶剂对照DMF组、溶剂对照DMSO组无明显差异,AH6809组较造模组略高,但无明显统计学差异(P>0.05),而L161982组CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞比例较造模组明显升高(P<0.05)。上述结果表明EP4受体阻断剂增加了CIA小鼠脾和引流淋巴结CD4+ Treg细胞的数量,而EP2受体阻断剂对此无明显影响。另外,造模组小鼠血清IL-17含量与溶剂对照DMF组、溶剂对照DMSO组无明显差异,AH6809组较造模组略低,但无明显统计学差异(P>0.05),而L161982组血清IL-17的含量较造模组明显减低(P<0.05)。结果表明EP4受体阻断剂可能减少CIA发病过程中Th17细胞的数量,而EP2受体阻断剂对此无明显影响。结论:本研究在细胞水平以Th0作为靶细胞研究了PGE2对Treg和Th17细胞分化的影响及及其受体学途径,在整体水平应用PGE2受体阻断剂观察对CIA小鼠病情和Treg/Th17细胞平衡的影响,得出以下结论:(1)小鼠脾来源的Th0细胞表面存在PGE2的四种受体亚型,其中EP2表达最强,EP4表达最弱。(2)细胞学实验表明PGE2抑制Th0向Treg细胞方向的分化;PGE2同样抑制Th0向Th17细胞的分化,上述作用通过EP2和EP4受体介导。(3)外源性PGE2抑制造模28天分离的脾细胞中CD4+ Treg细胞和Th17细胞的分化,该作用主要通过EP4受体介导。(4) EP2受体阻断剂和EP4受体阻断剂对CIA发病率和起病时间无明显影响,EP4受体阻断剂明显减轻CIA病情,但EP2受体阻断剂对病情无明显影响。(5)造模组小鼠脾和引流淋巴结中CD4+ Treg细胞数量明显减少,EP4受体阻断剂明显升高脾和引流淋巴结CD4+ Treg细胞数量,而EP2受体阻断剂对此无明显影响。造模组小鼠血清IL-17含量明显增多,EP4受体阻断剂明显降低IL-17分泌量,而EP2受体阻断剂对此无明显影响。本研究表明PGE2对Treg/Th17分化具有明确的调节作用,细胞实验显示PGE2对Th0向Treg和Th17的分化均具有抑制作用,但动物实验显示内源性PGE2通过EP4受体促进IL-17的产生同时抑制Treg细胞的分化而发挥明显的促炎作用,PGE2可通过调节Treg/Th17细胞平衡参与RA发病,EP4受体可能是RA的更精确的治疗靶点。