石榴皮多酚的分级制备及生物活性研究

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多酚是多羟基酚类化合物的总称,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抑制高血压及预防心血管疾病等多种功能,广泛应用于食品、日化等行业。我国石榴资源丰富,占石榴总重20%~30%的果皮含有丰富的多酚类物质,但是很大一部分石榴皮未被开发利用。因此,对石榴皮多酚的研究具有重要的现实意义。本文以干燥石榴皮为研究对象,采用超声辅助提取法对石榴皮多酚进行提取,经过微滤-超滤膜联用技术对其纯化,采用不同孔径的超滤膜对纯化后的石榴皮多酚进行分级制备,研究不同石榴皮多酚组分的体外抗氧化活性和对PC-3人前列腺癌细胞生长抑制作用,并探索石榴皮多酚对PC-3细胞凋亡的调控机理。主要结论如下:(1)采用超声辅助提取法提取石榴皮多酚类物质,通过单因素实验和正交实验分析,确定最佳提取工艺条件为:乙醇浓度60%(v/v),固液比1:35(m/v, g/mL),超声提取时间30min,粒径大小100目,在此提取条件下,石榴皮多酚提取率达到了182.8±3.4mg/g。(2)采用微滤-超滤膜分离联用技术对提取石榴皮多酚(Pomegranate pericarp totalpolyphenol, PTP)进行分离纯化。最终确定微滤工艺条件为:膜孔径0.2μm,操作压力0.18MPa,多酚透过率达到93.4%,蛋白质、总糖和固形物截留率分别为18.45%、4.21%、10.59%;超滤工艺条件为:膜孔径为8000Da,操作压力为18bar,多酚透过率达到79.03%,蛋白质、总糖和固形物截留率分别为80.59%、52.32%、61.28%;通过微滤-超滤膜联合处理使石榴皮多酚纯度由23.75%提高到39.53%,最终得率为73.84%。(3)将微滤-超滤膜分离联合处理的石榴皮多酚(PTP0)依次通过分子量3000Da和1000Da的超滤膜,得不同多酚含量和种类的三个级分PTP1、PTP2、PTP3,并通过抗氧化活性和PC-3细胞抑制率指标的测定,探讨PTP、PTP0、PTP1、PTP2和PTP3的生物活性。结果表明,相比于石榴皮多酚的粗提物PTP,纯化后的PTP0具有更强的抗氧化和PC-3细胞抑制作用;在PTP1、PTP2、PTP3三个级分中,PTP2抗氧化和抑制PC-3细胞作用最强。(4)通过观察凋亡细胞形态以及检测细胞凋亡、线粒体膜电位及凋亡相关蛋白和酶的表达,探讨了PTP2对PC-3细胞的作用机制。形态学观察结果表明,PTP2能改变细胞形态,具有促PC-3细胞凋亡的作用。流式细胞仪检测的结果对此进行了验证,随着PTP2浓度的增加,线粒体膜电位发生变化,PC-3细胞凋亡率增加。凋亡关键蛋白和酶的表达情况说明,PTP2是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,促进促凋亡蛋白Bax表达和Cyt C的释放,同时激活凋亡关键酶Caspase-3,导致细胞发生了不可逆凋亡。因此,PTP2促PC-3细胞凋亡的作用机制可能是线粒体通路介导的Caspase依赖性细胞凋亡。
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