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研究背景和目的术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老年患者手术后出现的一种复杂而常见的中枢神经系统并发症,以手术后数天或数周出现记忆缺失、注意力衰退、定向能力和抽象思维能力障碍、情绪异常,睡眠障碍等为特征。POCD常常会延长患者住院时间,增加医疗负担,并导致其社会活动能力和适应能力减退,严重影响患者生活质量。然而,迄今为止术后认知功能障碍的病理生理学机制尚未完全阐明,尚无有效的治疗措施。因此,针对POCD发生发展机制进行深入研究,为POCD早期干预提供理论依据,对于提高老年手术患者生活质量显得尤为重要。小胶质细胞(Microglia,MG)异常激活诱导的神经系统炎症是POCD的重要病理学特征之一。小胶质细胞异常激活,释放肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)等炎症性因子,直接损伤神经元,同时可通过提呈抗原激活T-细胞对神经系统造成损伤。近年来研究表明POCD与其他神经退行性疾病之间有密切关系,而铁在脑内的增龄性沉积是神经退行性疾病的共同病理特征之一。脑组织内异常分布的铁离子诱导细胞产生氧化应激损伤,使细胞丧失正常功能。铁离子在神经系统发育及维持神经系统功能中发挥重要作用,而小胶质细胞是脑内铁储存的重要细胞。目前研究证明铁离子的增加与神经退行性疾病相关的认知降低有关,铁离子在神经退行性疾病中的作用已成为防治此类疾病的研究热点和发展方向之一。铁螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)已被用于多种神经退行性疾病的动物模型研究,具有良好的应用前景。POCD是以小胶质细胞异常激活诱导的神经系统炎症为重要病理学特征的中枢神经系统并发症。小胶质细胞铁代谢在POCD中是否有作用及其可能的作用机制尚不清楚。本课题组前期实验已证明老年大鼠海马组织中存在增龄性铁沉积的现象。本研究拟通过离体和在体实验探索铁离子代谢改变与激活小胶质细胞之间的潜在关系,评估铁代谢改变对海马小胶质细胞激活及术后认知功能障碍的影响,期望为POCD的早期干预,有效防治提供一个新的思路。实验方法1.构建老年C57BL/6小鼠POCD模型。12-14月龄C57BL/6雄性小鼠(体重25-32g)随机分为5组:正常对照组(Control),假手术组(Sham),剖腹探查手术组(Surgery),剖腹探查手术前连续6天腹腔注射100mg/kg去铁胺组(DFO+Surgery),剖腹探查手术前连续6天腹腔注射等量生理盐水组(NS+Surgery)。各组动物运用条件恐惧实验(Fear condition test)评估海马依赖的认知功能改变。2.免疫荧光(Immunofluorescence)观察海马组织小胶质细胞形态变化,免疫蛋白印迹法(Western blot)检测小胶质细胞活性蛋白CD68及记忆相关蛋白脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达。3.Iron Assay kit(Colorimetric)检测海马组织铁含量,Western blot检测铁代谢相关蛋白表达。试剂盒检测海马组织内MDA活性和羟自由基(·OH)含量。4.建立体外小胶质细胞激活模型。采用完全贴壁法培养BV2小胶质细胞株,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS 20μg/ml)建立小胶质细胞激活模型。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小胶质细胞内IL-6,TNF-α,IL-1β含量。Iron Assay kit(Colorimetric)检测细胞总铁和二价铁离子(可变铁)水平,Western blot检测铁代谢相关蛋白Ferroportin1(Fpn1)、Divalent metal transporter 1(DMT1)、Hepcidin和Ferritin表达,小胶质细胞活性标记蛋白CD68及记忆相关蛋白BDNF表达变化。5.DFO预培养BV2小胶质细胞6小时,脂多糖诱导,观察小胶质细胞CD68和BDNF表达改变。Western blot分析铁代谢相关蛋白表达及氧化应激相关蛋白表达。Calcein-AM观察细胞内可变铁池的变化,Iron Assay kit(Colorimetric)测量细胞内总铁离子和二价铁离子含量。结果1.Fear condition test实验结果表明,与正常对照组比较,手术组僵立时间(Freezing time)显著缩短(P<0.05),而消退时间(Extinction time)比正常对照组显著延长(P<0.01),剖腹探查手术可造成条件恐惧记忆消退延迟。2.手术后海马区CD11b阳性小胶质细胞数量显著增加,胞体变圆,突起增粗,表明小胶质细胞异常激活。CD68蛋白表达增加,BDNF蛋白表达下降,与正常对照组有显著差异(P<0.05)。同时海马区铁离子含量手术后显著增加,Fpn1表达减少,DMT1,Hepcidin表达增加。3.Fear condition test结果显示,DFO处理(100mg/kg)后再接受剖腹探查手术,尽管与正常对照组比较,DFO处理组僵立时间(Freezing time)减少,恐惧记忆消退时间延长(extinction time)(P<0.05),但DFO处理组僵立时间和恐惧记忆消退时间较手术组显著缩短(P<0.01)。4.含LPS(20μg/ml)培养基培养BV2小胶质细胞16小时,Western blot结果显示,CD68蛋白表达急剧增加,记忆相关蛋白BDNF表达显著减少。ELISA结果显示培养基内炎性因子:TNF-α、IL-6以及IL-1β含量显著增加(P<0.01)。5.LPS诱导后,小胶质细胞膜铁转运蛋白1(Fpn1)表达减少,二价金属离子转运蛋白DMT1、铁调节激素Hepcidin的蛋白表达均显著增加,LPS激活小胶质细胞后细胞内总铁离子(0.3792±0.0349 vs Control 0.2221±0.0311 P<0.001)和二价铁离子(Ferrous iron,0.1899±0.0155 vs Control 0.1185±0.0122 P<0.001)含量增加,铁储存蛋白Ferritin表达下调。6.DFO(5m M/L)处理BV2小胶质细胞6小时,再加入LPS(20μg/ml)培养16小时,CD68表达明显下降,BDNF蛋白水平明显增加,Fpn1表达增加,DMT1、Hepcidin的蛋白表达均减少。总铁离子含量(0.3084±0.0444 vs LPS 0.3792±0.0349 P=0.002)和二价铁离子含量(0.1409±0.0129 vs LPS 0.1899±0.0155 P<0.001)均明显降低。7.DFO处理能够下调LPS诱导的gp91和p38蛋白表达,DFO处理可减少术后海马区MDA和·OH的产生。结论1.剖腹探查手术可建立C57BL/6老年鼠POCD模型。2.手术创伤引起海马小胶质细胞异常激活,海马依赖的学习记忆功能受到损伤。同时伴随铁转运蛋白表达改变,铁沉积增加。3.DFO可有效抑制老年C57BL/6小鼠脑内手术创伤引起的小胶质细胞异常激活,减轻海马区氧化应激反应,改善术后认知功能障碍。4.LPS(20μg/ml)处理小胶质细胞,可有效激活小胶质细胞,从而建立体外小胶质细胞激活模型。5.活化的小胶质细胞释放炎症因子,Hepcidin表达增加,亚铁离子转入蛋白DMT1上调,转出蛋白Fpn1下调,同时Ferritin表达下降,细胞内总铁离子和二价铁离子含量均增加。上述铁调节蛋白表达改变可能是导致活化小胶质细胞内铁离子含量增加的原因。6.DFO处理能有效降低细胞内铁含量,促进细胞内铁离子流出,减少炎症因子分泌,增加记忆相关蛋白的表达,进一步说明细胞内铁离子含量增加与小胶质细胞激活有一定相关性。7.氧化应激反应参与了炎症—铁沉积—小胶质细胞激活的损伤过程。