研究背景尽管乙肝病毒疫苗已经在全球多数国家广泛应用,但乙型病毒性肝炎(Hepatitis B virus, HBV)呈全球性分布,目前全球仍有超过3.5亿的慢性乙肝病毒感染者(Chronic hepatitis B virus, CHB),其中有些已经发展为失代偿性肝病、肝硬化、原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。2006年我国乙型肝炎流行病学调查结果显示,1-59岁人群HBsAg携带率为7.18%,5岁以下儿童的HBsAg携带率仅为0.96%。目前拉米夫定(Lamivudine, LAM)、阿德福韦(Adefovir dipivoxil, ADV)、替比夫定(Telbivudine, LDT)和恩替卡韦(Enticavir, ETV)等已经在我国批准用于治疗CHB患者,然而由于LAM、ADV、LDT等药物耐药屏障较低,HBV耐药发生率较高,其中拉米夫定耐药率最高,5年可达80%,YMDD变异是目前最常见的耐药突变。由于HBV逆转录酶(Reverse transcriptase, RT)基因和编码HBsAg的S基因是完全重叠的,故HBVRT发生耐药突变可能会导致S基因出现变异,进而影响HBsAg的编码和抗原活性,反之亦然。HBsAg是HBV颗粒的表面包膜蛋白,是HBV的保护性抗体(HBsAb)作用的主要靶抗原,尤其是主要亲水区(Major hydrophilic region, MHR),该区域编码位于HBsAg的99-169位氨基酸。S基因出现突变以后可能会导致疫苗免疫逃避和HBsAg不能被常规商业化诊断试剂所识别,也可能会增加隐匿性乙型肝炎感染(Occult hepatitis B infection, OBI)的发生率,甚至会加重肝脏疾病的进展。体外和动物研究显示当S基因出现sW182*/rtV191I, sW172*/rtA181T和sW196*/rtM204I等突变可能会导致HCC的发生率增加。那么这些编码HBsAg的S基因在经核苷类药物治疗的患者中突变情况如何呢?目前尚无明确和系统的报道。研究目的1、探讨经核苷类药物治疗后耐药患者其基因型和耐药突变类型之间的关系。2、研究出现YMDD耐药突变患者的耐药相关S基因突变情况和S基因终止突变分布规律。3、研究ADV耐药突变患者耐药相关S基因突变情况和S基因终止突变分布规律4、比较经核苷类药物治疗后的未耐药患者、YMDD突变患者、ADV耐药患者S基因MHR区突变特点。5、探讨不确定的基因型的序列特征。研究材料和方法1.样本来源：从2009年12月至2011年12月就诊于广州南方医院、佛山市第一人民医院和河南省人民医院的患者,分别为1161例、61例、148例。上述所有患者均接受核苷类药物治疗且临床怀疑或监测耐药,HBeAg (?)日性或阴性,无HIV、HCV、HDV等感染史,收集所有患者血清,并储存于-30℃。2. HBV DNA提取：收集患者血清,使用凯杰公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit,根据操作说明从200微升血清中提取HBV DNA用于下一步操作。3. HBV DNA逆转录酶区(Reverse Transcriptase region, RT)扩增：使用巢式PCR对HBV RT区进行扩增,对其扩增产物送上海英骏公司测序。4.测序结果分析：从Genebank中下载从A型—G型和I型序列作为参考序列,使用CLUSTALW对序列进行比对,并使用HBV S区做进化树进行基因分型,http://lifecenter.sgst.cn/hbv/cnv/search、http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseql和http://hbv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php等在线序列网站对序列的基因型、耐药突变位点、S基因突变情况进行分析确认。对于基因分型不确定的进行全长扩增,并使用NCBI的基因型分型工具进一步分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。5.统计学分析：所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析,率的比较用χ2检验或Fisher检验,所有结果均采用双侧检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.HBV患者基因型和耐药突变类型分析：1.1基因型分析共有773例PCR阳性,并且成功测序。其中B型342例(44.24%),C型428例(55.37%),D型1例(0.13%),不确定型2例(0.26%)。2例不确定型序列在不同的在线耐药检测网站中分别被判定为G型或I型,我们对其中1例进行了全长扩增,经比对发现该序列可能为I基因型,NCBI分型工具提示可能为不同基因型的重组所致,BLAST比对发现与广西发现的X/C重组体有98%的相似性,且该患者亦为广西患者,故将其判定为X/C重组体,最近有研究者将该株病毒命名为“I”基因型。1.2YMDD突变患者耐药突变类型分析有211例(27.30%)患者具有YMDD突变,13种突变类型,其中rtM204I单独突变最多有103例(48.82%),B基因型和C基因型分别占57例和46例,该突变在B和C基因型中的分布无统计学差别(P=0.148,X2=2.096);其次是rtM204V+rtL180M突变有49例(23.22%),包括B基因型和C基因型分别为37例(34.91%,37/106)和13例(12.38%,13/105),该突变在两个基因型中的分布差异具有统计学意义(P<0.001,X2=14.801)；rtM204I+rtL180M突变有20例(9.48%),包括B型4例和C型16例,该突变类型更多的分布于C基因型,且两种基因型之间的差别具有统计学意义(P=0.004, X2=8.08);rtM204V+rtL180M+rtV173L则全部分布于C基因型,且B和C基因型之间有统计学差别(P=0.001,X2=11.716)。1.3ADV耐药患者突变类型分析：在所有患者中共检测到82例(10.61%)患者具有ADV耐药突变,B和C基因型分别有31例和51例。这些患者共有14种耐药突变类型,其中rtA181V、 rtA181T、rtN236T、rtA181T+rtN236T和rtN181V+rtN236T分别有20例、17例、15例和12例,其中rtN236T突变在B型和C型分别有13例和2例,该突变在两种基因型的分布具有统计学差异(P<0.001,X2=18.641)。rtA181S/I、 rtA181G+rtT184G、rtA181T+rtM250L、rtMA181T+rtN236T+rtM250L、 rtA181V+rtL180M和rtA181T+rtN236T+rtV173L等突变亦可检测到。2.常见耐药突变位点所对应的S基因突变特点分析2.1YMDD突变患者耐药相关的S基因突变特点rtM204I可以导致S基因出现sW196L、sW196S和sW196*三种类型的突变,本研究中分别有110例(B型45例和C型65例)、22例(B型17例和C型5例)和2例(B型1例和C型1例)出现上述三种类型的突变。其中sW196L突变主要分布于C基因型(P=0.002,X2=9.192),而sW196S突变则在B基因型中分布较多(P=0.002,X2=9.674),sW196*仅有2例(B型和C型患者各有1例)。77例rtM204V突变则仅导致s1195M突变。rtV173L突变导致sE164D突变,本研究中所有rtV173L/sE164D均分布于C基因型,C基因型和B基因型的这种差别具有统计学意义(P<0.001)。2.2ADV耐药患者所对应的S基因突变特点与以往的研究类似,rtA181T突变多数可以导致sW172*突变,但是该耐药突变亦可导致sW172V和sW172L突变,且后一种突变共有6例均分布于C基因型中。rtA181V/G/I/S突变分别可以导致S基因出现sL172F、sL173V、sW172*和sW172C三种类型的突变,其中rtA181I/sW172*突变在未见以往文献报道。3.S基因的MHR区变异特点分析YMDD突变患者、ADV耐药患者和无耐药突变患者分别有128例(60.66%)、62例(75.61%)和211例(44.51%)具有MHR位点变异,三者在B基因型(P=0.001,X2=14.175)和C基因型(P=0.002,X2=12.274)中的分布具有统计学差别。根据MHR区的氨基酸特点和功能,参照既往研究分析,发现MHR区的124-137位氨基酸区段,在B基因型中YMDD突变患者和ADV耐药突变患者氨基酸突变个数明显多于无耐药突变患者(1.46Vs.2.56Vs.2.07,P=0.037,X2=6.576),而该差别在C基因型无统计学意义(2.57Vs.2.52Vs.2.52,P=0.993,X2=0.014)。而在C基因型患者,MHR的149-169位氨基酸突变数量在YMDD突变患者中最高,无耐药的患者最少,三组相比具有统计学差别(YMDD突变组Vs.ADV耐药组Vs.无耐药组=1.13Vs.0.84Vs.0.5,P=0.008,X2=9.546)。4.S基因终止密码突变分析在YMDD突变患者检测到8例具有S基因终止密码子,分别有4例分布于B基因型和4例分布于C基因型,其突变类型有：sS53*、sS61*+sC69*、sW74*、sW196*、sY100*+sW196*、sY206*、sL216*,其中rtM204I所对应的sW196*突变,仅发现2例(1.49%,2/134)。终止密码子在B型和C型YMDD突变患者中的分布无统计学差异。与既往研究类似,rtA181T突变可以导致sW172*突变,但并不是所有的rtA181T均导致该突变。在本研究中,ADV耐药患者共有6种终止密码突变类型,分别为：sW172*、sW172*+sW199*、sW172*+sC76*、sW172*+sC69*、 sW172*+sW182*、sY200*+sW201*等。其中rtW172*最多,有25例,其次是sW172*+sW199*和sW172*+sW182*各有2例,其余突变类型均发现1例。该组患者S基因终止突变亦无B和C基因型分布差别。在经核苷类药物治疗但是未出现耐药的患者亦发现有8种终止密码突变,分别为：sS53*1例,sS61*1例,sC69*2例,sC69*+sW74*1例,sW182*4例,sW196*1例,sW201*1例,sW216*1例。与前述sW196*突变是由于rtM204I所致不同,该组患者也具有sW196*突变,但是由rtD205N突变所致,该突变是否可以导致耐药目前还不确定。结论1.在该研究中发现2例可能为I基因型病例,其中1例已得到确认。2. rtM204I+rtL180M主要分布于C基因型,rtM204I+rtL180M突变主要分布于B基因型,而rtM204V+rtV173L+rtL180M全部分布与C基因型。rtN236T主要分布于B基因型,而rtA181T在B和C基因型中的分布无统计学差别。3. rtM204I突变仅有少部分导致S基因出现sW196*突变,多数导致sW196L突变,部分导致sW196S突变。其中C基因型导致sW196L突变的比例多余B基因型,而B基因型中导致sW196S的比例多余C基因型。4.并非所有rtA181T突变均导致sW172*突变,有少数可以导致sW172V和sW172L突变。5. YMDD突变患者和ADV耐药患者MHR变异数量较经核苷类药物治疗而无耐药突变的患者多,且具有基因型差别。6.S基因终止密码突变在经核苷类药物治疗的人群中均可检测到,但无基因型分布差别。