乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是一个全球性的健康问题,全世界约有4亿人受到影响,每年有约一百万人死于失代偿性肝硬化或肝癌。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在最常见的癌症中排名第六,同时在癌症相关死亡因素中位列第三。HBV感染在中国和东南亚尤为流行,约有高达85%的肝癌患者其乙肝表面抗原(Hepatitis B Virus surface Antigen,HBsAg)呈现阳性。据估计,中国约有9300万例乙肝病毒携带者,其中包括约2000万例慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者。HBV基因序列为总长度约3.2kb的部分双链环装DNA构成,由四个相互重叠的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成:P、S、C、X分别编码病毒聚合酶、病毒表面抗原(L-HBsAg,M-HBsAg,S-HBsAg)、X调控蛋白(Hepatitis B x antigen,HBx)以及病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)。P区主要包含末端蛋白,逆转录酶(Reverse Transcriptase,RT),非编码间隔区以及RNA酶H区。由于在HBV复制过程中其聚合酶缺乏校对活性,导致HBV基因序列变异较大,其在患者体内拥有较高的变异率并以复杂的准种形式存在。以往的研究,主要基于一代测序技术(Sanger测序法),其受限于得到的序列结果数目,仅能够对HBV的基因序列进行有限的获取和分析,难以更为全面的对基因突变、准种等信息进行描绘和探索。如今,二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)逐渐走入临床应用,相比一代测序技术NGS有明显的高通量和高灵敏度优势。二代测序技术可以最大限度对HBV所有准种进行采样,从而最大程度地获得接近患者体内真实的HBV准种和突变序列。本课题利用二代测序的固有优势对HBV基因序列进行深层次大规模测序,结合生物信息分析手段,探究HBV突变程度对抗病毒药物的影响,对乙肝表面抗原免疫逃避以及评估其作为区分肝炎和肝癌的效果。第一部分:基于NGS的原发性肝癌HBV-RT区耐药位点特征分析本项目旨在探讨本地区HBV相关HCC患者HBV RT区的多耐药位点特征,以及经过长期的随访,主要根据患者HBV DNA水平变化,对病毒学突破组,部分病毒学应答组,病毒学应答组患者三组人群的HBV RT区基因差异对比,阐述可能导致耐药现象的位点。三组中有6个显著差异位点:L180M、T184A、S202G、M204V/I、N238H。其中N238H可能为两个新的耐药位点,它们在病毒学突破组中平均突变率为3.411%和23.801%,在部分病毒学应答组中的平均突变率分别为0.021%及1.041%。通过77例HBV相关HCC患者的常见耐药位点统计分析,我们观察到在HBV相关性HCC中,M204V/I及L180M+M204V/I耐药突变位点的突变率最高,其次为A181T/V,它们在患者中的突变率分别为12.99%、16.88%和11.69%。此外,通过文献搜索及归纳比较,我们把55个已经报道的耐药位点分为四类,即为基础耐药突变位点、补偿性突变位点、推测性耐药突变位点、治疗前突变位点,分别计算了这些突变位点在三组的突变率且比较了差异。并且通过对患者用药方案及病毒水平变化的长期随访,表明了二代测序对患者的抗病毒治疗用药指导切实有效。第二部分原发性肝癌HBsAg+/HBsAb+双阳性者S区序列特征分析本研究主要分析HCC患者中HBsAg+/HBsAb+双阳性患者临床及HBV S区序列特征。探究了HBsAg+/HBsAb-患者及HBsAg+/HBsAb+患者是否在RT区及S区氨基酸存在差异。通过对两组患者在RT区和S区所有氨基酸位置的突变特征聚类分析,发现以RT区氨基酸突变为特征时,不能完全把两组患者区分开来。而以S区氨基酸突变为特征聚类则可以把两组患者完全区分开,并且HBsAg+/HBsAb+组患者在主要亲水区(MHR)的突变率高于HBsAg+/HBsAb-组患者。通过差异位点对比、过滤、筛选,最终我们发现有25个S区突变位点在两组患者中有明显差异,结合功能分析等方法,发现其中有10个位点差异相较于其他15个位点更加显著:S204R、F220C、F219S、V224A、I195M、W196L、T131N、M133S、T47K、V190A。本研究通过二代技术,阐述了HBsAg+/HBsAb+双阳性患者突变情况,揭示了可能引起HBsAg免疫逃避的位点情况。第三部分HBV相关肝病RT/S区基因序列特征分析及预测模型构建本研究利用二代测序技术比较了HBV RT区在CHB和HCC患者间的差异特征,以及利用这种特征构建模型辅助疾病的预测和诊断。选取HCC(n=77)、CHB(n=76)且都为HBV C基因型的患者,比较其在核苷酸、RT区氨基酸、S区氨基酸的差异位点。发现在多个核苷酸位点上HCC的突变均高于CHB,且这种差异明显的位置均匀分布在所有核苷酸位置上。通过对两组患者所有核苷酸突变情况进行聚类,能够将HCC及CHB较好的区分开。此外,通过两组患者在RT区及S区氨基酸的差异比较、筛选、过滤等分析方法,分别发现45个RT区和49个S区具有统计学差异的突变位点。我们构建了KNN(k-nearest neighbors algorithm),SVM(support vector machine),RF(random forest),LR(logistic regression)等模型。发现KNN及RF适用于此类特征,能够较好地区分HCC及CHB患者。其中基于HBV rt1区数据的KNN模型AUC能够在独立验证集中达到0.9074。基于HBV rt2区数据的KNNAUC模型能够在独立验证集中达到0.9146,并且联合HBV rt1及rt2的突变特征其AUC能够达到0.9261。这表明该模型能够非常好地区分HCC和CHB患者。本研究揭示了利用二代测序计算及有效分析得到的HBV特征性突变也许可以作一种新的“标志物”对HCC及CHB进行区分,为临床肝癌预警标志物研究打开了新的思路。第四部分CHB及HCC患者中血清HBcrAg与HBV病毒载量的关系乙肝病毒核心抗原相关抗原(HBcrAg,Hepatitis B core-related antigen)作为能够反映HBV载量的新标志物,其在乙肝相关肝癌患者中的应用没有得到充分的阐述。本研究同时在CHB及HCC患者中评估HBcrAg衡量血清中HBV DNA及肝内HBC cccDNA水平的能力。研究表明,CHB患者中HBV DNA、HBcrAg以及HBeAg的分布水平均高于HCC患者。HBcrAg与HBV DNA之间的强相关性不受HBeAg阳性与否影响。在所有227例患者中,HBcrAg与HBV DNA有很强的相关性(r=0.767,p<0.001)。在HCC患者中,HBcrAg也与HBV DNA有很强的相关性(r=0.785,p<0.001)。此外通过检测89例HCC患者的肝癌组织中cccDNA水平,分析发现HBcrAg与cccDNA之间的相关性与HBV DNA、cccDNA之间的相关性相当,都有很强的相关性。但是在HBV DNA≤4 log IU/ml时,HBV DNA与cccDNA之间无相关性(r=0.117,p=0.587);相比之下,HBcrAg与cccDNA之间仍有较好的相关性(r=0.407,p=0.049)。这些结果表明,HBcrAg还可以作为一个衡量cccDNA的有效诊断指标,尤其是在低病毒载量的HCC患者中。