斑马鱼Ly2基因簇的鉴定、表达与功能研究

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淋巴抗原6 (lymphocyte antigen 6, Ly-6)首次在小鼠淋巴细胞中鉴别出。该家族氨基酸序列具有一个或多个保守的LU结构域,该结构域一般由70到100个氨基酸残基组成,包含8到10个可形成特定二硫键的半胱氨酸,其三级结构为三指蛋白,也称为三指蛋白。该家族分为两个亚家族:一个是分泌性蛋白,如SLURP 1, SLURP2, SP10, PATE家族和一些蛇毒素:另一类是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,如CD59, PSCA (prostate stem cell antigen), LYNXl (Ly-6/neurotoxin 1)。从低等的无脊椎动物如果蝇,到脊椎动物哺乳类都鉴定出Ly-6家族成员。它们的表达模式和功能具有多样性,在细胞活性、迁移、黏附,神经兴奋性调节和免疫调节过程中起重要的作用。近年来,报道中所鉴定出的Ly-6家族成员大部分为GPI锚定型蛋白,而对分泌性蛋白的发现与鉴定相对较少。更令人遗憾的是,虽然斑马鱼已经成为一个具有多种优势的重要模式动物,但在斑马鱼发育过程中,除了一些笼统的生物学信息学,Ly.6家族成员的鉴定和研究非常匮乏。在本论文中我们在斑马鱼鉴定了三个特异表达于消化系统的新的分泌性Ly-6基因。它们位于2号染色体三个相邻的位置,根据其在染色体上的相对位置,我们将其命名为Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3。它们编码的蛋白均具有一个由10个保守的半胱氨酸组成的LU结构域,并且这三个基因的氨基酸序列具有很高的相似性,推测是染色体内基因复制而来。通过三维同源建模分析,发现它们与CD59和SLURP1具有相似的类似三指的三级结构。此后我们通过胚胎的整体原位杂交和胚胎各个时期的实时定量PCR分析了Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3的时空表达模式。在斑马鱼胚胎发育的早期,它们均有不同程度的母源性表达,随着胚胎不断发育,三个基因呈现特异的时空表达模式,均在内胚层特异表达,但三个基因的具体表达位置不同。Ly2.1在鱼鳔和鳔管中表达,Ly2.2在72hpf的胰腺中特异表达。Ly2.3在整个消化道以及肝中表达。它们表达于斑马鱼的整个消化道,鱼鳔,肝和胰腺,消化道及相关器官在先天性免疫和适应性免疫应答中具有重要作用,此外,通过抗菌肽预测发现Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3均具有潜在的抗菌肽活性:富含10个半胱氨酸,等电点分别为8.5,8.2,8.2,疏水比分别为46%,48%,47%。基于此,我们选取斑马鱼发育的重要时期进行了LPS脂多糖显微注射来模拟感染和细菌入侵。通过实时定量PCR结果显示,在不同发育时期的斑马鱼胚胎注射LPS之后,发现三个基因mRNA水平的表达量都有了不同程度的升高。基于此,我们初步认为在斑马鱼早期胚胎发育过程中,Ly2.1-3在消化道初先天性疫应答中起到重要的作用。总而言之,本文鉴定了斑马鱼2号染色体上三个Ly-6超家族成员,Ly2.1,Ly2.2,Ly2.3,它们的表达部位均在内胚层上,但三者的具体表达并不相同,提示染色体内基因复制后三者可能执行不同的功能,而LPS处理后三者的表达升高提示它们均在免疫调节中起作用,具体的抗菌功能研究仍有待深入。
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