基于QTL-seq的水稻(Oryza sativa L.)粒重QTL定位及候选基因筛选

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:LAP281482184
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粒重是水稻重要的产量和品质性状,近年来也有一批与水稻粒重相关QTL被定位和克隆。但是,环境地域和品种等因素限制导致很多定位到的QTL利用价值不大,真正运用到改良水稻种质的基因很少,所以进一步的定位克隆水稻粒重基因对加快优势基因聚集和高产优质的水稻新品种的选育十分必要。本实验利用籼稻种质B91(小粒)及B233(大粒)及两者杂交构建的F2群体为研究材料,分析影响粒重的关键表型性状,通过QTL-seq结合RT-PCR和SNP分型挖掘粒重相关的遗传位点与候选基因,以期进一步了解多基因调控粒型性状的遗传基础。研究结果如下:(1)B91和B233的粒长,粒宽,粒厚,千粒重等性状均为极显著差异。两者杂交F1代种子粒长,粒宽,粒厚,千粒重性状介于亲本之间,F2代群体千粒重为标准的正态分布,证明两个亲本之前粒型差异的为微效多基因控制,不存在效应值很大的主效基因。(2)籽粒颖壳和胚乳扫描电镜观察结果表明,B233与B91粒长,粒宽,粒厚的差异是由细胞大小和细胞数量共同决定的,且B233相比B91籽粒饱满度较差。通过灌浆参数的比较,B233起始生长势,活跃灌浆时间,最大灌浆速率等指标均大于B91。说明B233和B91之间的粒重差异由水稻颖壳和胚乳发育共同决定。(3)选择F2代粒重极端表型个体构建了两个混合池,对两个亲本和两个混合池分别进行30×的全基因组重测序,共在两个亲本中得到了430762个有效SNP位点,利用QTL-seq在水稻2号、4号、5号、7号、9号5条染色体上定位了7个QTL。为了更好的对候选基因进行筛选,在QTL区间内筛选出在△(SNPindex)>0.7的共51个SNP位点,选出在基因中非同义突变及剪接位点上的突变,共计在QTL位点内获得35个粒重的候选基因(包括3个已被克隆基因)。(4)使用水稻开花前幼穗2cm,幼穗5cm和10cm三个时期以及开花后第2天、第5天、第12天、第22天共7个时期的一次枝梗上未成熟水稻籽粒作为实验样品,提取总RNA。通过实验验证q PCR引物设计数据库q Primer DB database网站上提供的基因引物的可靠性,筛选出特异的q PCR引物,进行q RT-PCR分析,共在两个亲本中筛选到15个差异表达的基因。(5)基于120份水稻的自然群体的重测序数据进行SNP分型和SNP聚类分析,筛选出了9个对粒重有显著或极显著影响的基因(Os04g0619600,Os04g0625400,Os04g0617600,Os04g0631000,Os04g0626700,Os04g0626100,Os04g0655000,Os04g0623400,Os09g0313600)。本次定位到的9个基因中有7个基因(Os04g0619600,Os04g0625400,Os04g0617600,Os04g0631000,Os04g0626700,Os04g0626100,Os04g0623400)在水稻四号的染色体的771.3kb的范围内,可能为控制水稻粒重性状的基因簇。(6)通过Rice 3000公共数据资源进一步对筛选到的SNP位点进行验证,发现了7个基因在利用Rice 3000的公共数据进行SNP分型后存在显著或极显著差异(Os04g0619600,Os04g0617600,Os04g0631000,Os04g0626700,Os04g0626100,Os04g0655000,Os09g0313600),也证明了这次的基因筛选是可靠的。通过上下游基因预测网站Rice Net DB,STRING和Plant Regulomics筛选定位到基因的上下游基因,发现基因Os04g0619600和Os04g065500上下游的调控网络极为相似。遗传进化树分析表明,基因Os04g0631000,Os04g0619600,Os04g0617600,Os04g0626700,Os04g0655000等与已经克隆的粒型基因序列具有较高的同源性。基因家族分析发现Os04g0626700与OS04g0619600基因最有可能为粒型的候选基因。综上所述,本研究通过QTL-seq获得多个粒重紧密关联的遗传区间,通过基因注释、表达模式分析及进化分析,鉴定出Os04g0619600,Os04g0626700是影响粒重的候选基因,后期将通过转基因验证这三个基因的真实性。本研究结果丰富了粒重性状的多基因调控的理论基础,为后续的粒重基因的克隆打下基础。
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