在世界范围内,念珠菌、曲霉及其他侵袭性真菌感染(IFIs),一直是导致免疫缺陷患者住院和死亡的主要原因之一,尽管越来越多新型抗真菌药物的研发和应用,以及对抗真菌药物药代学/药动学认识的不断加深,但IFIs患者的致残率及病死率一直居高不下,给个人和社会带来了严重的经济负担。临床治疗中,快速准确地诊断出真菌感染以及鉴定出真菌的种属,才能及早给予合适的抗真菌治疗,从而减少住院天数、降低治疗费用和病死率。目前IFIs的诊断方法主要有组织病理学检查、真菌培养、影像学检查以及真菌特异性抗原检测。组织病理学检测需要检验医师有丰富的临床经验,但对于少见或者罕见的地方性真菌存在经验缺乏,以及部分真菌形态结构相近,仅凭真菌结构特点难以区分的问题；无菌部位(血液、脑脊液、肺组织)的培养结果是检验的金标准,但是阳性率不高,同时培养周期较长；影像学检查不具备高度的特异性；真菌特异性抗原检测虽然有较高的敏感性和特异性,但也存在一定假阳性和假阴性。因此,如何使检验时间缩短,提高检验方法的敏感性、特异性一直是真菌检验的关键问题,也是当下真菌检验学的热点。分子生物学的迅猛发展尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术和基因测序的发展,为提高真菌检验水平创造了条件。PCR技术发明于1985年,很快便被用于临床检验,如检测细菌、病毒、结核和真菌等,其中用PCR检测诊断结核、流感感染已被临床上所认可。用PCR检测真菌也一直是研究的热点,目前有大量的文献表明PCR在诊断IFIs方面较传统方法有着明显的优势,PCR检测扩增真菌核糖体高度保守序列可以使检测涵盖绝大多数真菌种类,扩增核糖体易突变序列可以鉴定真菌到种。双脱氧链终止法(Sanger法测序)对DNA片段进行测序,从而获得该段DNA的序列,在Genbank进行对比便能分析该DNA片段的同源性和突变情况。目前Genbank中有大量用Sanger法测序的真菌DNA序列,也有大量文献用Sanger法获得真菌核糖体序列后在Genbank进行对比来鉴定真菌种类和突变情况。临床常见的病原真菌有曲霉、念珠菌、隐球菌、毛霉,还有一些少见的真菌,如链格孢霉、赛多孢子菌等。在肺部真菌感染中,曲霉和隐球菌容易形成结节和(或)空洞病灶,临床诊断时常难以与肿瘤区分,往往在术后病理诊断中才证实为真菌感染。在这些病理标本中,有一部分靠目前的病理诊断方法难以确定真菌的种类,一直是困扰真菌检验的主要问题。本研究应用PCR检测和Sanger法测序两种方法,对石蜡包埋肺切除组织中真菌进行检测,以期为临床病理标本真菌感染的诊断和真菌种属的鉴定提供帮助。第一部分分子生物学检测真菌方法的建立与评估目的：通过设计真菌通用引物、曲霉属和隐球菌属特异性引物,用PCR和Sanger法测序检测临床12种常见真菌的标准菌株,以验证引物的特异性和PCR和Sanger法测序的敏感性和特异性。方法：实验组为12份标准菌株,包括曲霉(4种)、念珠菌(4种)、隐球菌(3种)和毛霉(1种),对照组为6份非IFIs石蜡包埋肺切除正常组织。用试剂盒提取两组标本中DNA,分别用真菌通用引物、曲霉属和隐球菌属特异性引物来检测真菌、曲霉和隐球菌；同时用真菌通用引物来扩增阳性的PCR产物行Sanger法测序,再在Genbank进行同源性分析,鉴定真菌的种类。结果：①12份标准菌株真菌通用引物扩增结果皆为阳性；4种曲霉用曲霉属引物扩增均为阳性,其余真菌用曲霉属引物扩增均为阴性；3种隐球菌用隐球菌属引物扩增均为阳性,其余真菌用隐球菌引物扩增均为阴性；6份非真菌感染病理组织所有扩增结果均为阴性。用PCR方法检测真菌的敏感性和特异性均为100%。②12种真菌Sanger法测定序列经Blast分析,各菌株结果与标准菌株完全相符。结论：本研究通过设计真菌通用引物、曲霉属和隐球菌属引物,通过PCR和Sanger法测序检测,证实本研究所用引物具有高度的特异性；PCR检测具有高度敏感性和特异性；Sanger法测序能准确地鉴定真菌的种类。第二部分分子生物学方法检测临床石蜡包埋肺组织中的真菌目的：用PCR和Sanger法测序检测临床标本中的真菌。方法：收集2000年7月至2014年10月间在南京军区南京总医院行手术切除并病理证实为真菌感染的肺组织标本40份和非真菌感染的正常肺组织标本6份,用PCR和Sanger法测序检测上述标本。结果：①在肺部真菌感染标本的检测中,40份标本真菌通用引物扩增结果皆为阳性,22份标本曲霉属引物扩增阳性,18份标本隐球菌属引物扩增阳性,曲霉属引物和隐球菌属引物扩增阳性结果无交叉；6份非真菌感染组织标本所有扩增结果皆为阴性；PCR检测对组织学镜检为阳性肺部真菌感染标本的敏感性和特异性均为100%；②在种属鉴定中,镜检能鉴定到属的标本27份,PCR能鉴定到属的标本40份,PCR检测优于镜检(100%vs 67.5%,P<0.05)；③在种属鉴定中,Sanger法测序能鉴定到种的标本35份,Sanger法测序与镜检虽无明显差异(87.5%vs 67.5%,P>0.05),但Sanger测序能鉴定真菌到种别。④PCR与Sanger法测序Kappa分析显示K值为0.775,有较好的一致性。结论：对于真菌感染(主要是曲霉和隐球菌)肺组织标本,PCR和Sanger测序是高度敏感和特异的检测方法。