论文部分内容阅读
微藻能够生产多种具有独特经济价值的产物,而微藻产业的发展的关键问题便是如何实现微藻的高密度大规模生产。通过基因工程技术改变微藻营养模式,使其能够利用外源碳源进行异养生长,已经作为解决上述关键问题的一种策略。莱茵衣藻由于其生长速度快,遗传背景清晰、能够表达高活性蛋白等特点,有着巨大的发展潜力,但是其生物量低,自养生长受光照影响等问题限制了其作为生物反应器的发展。葡萄糖转运蛋白Glut1作为葡萄糖转运的载体,在葡萄糖跨膜运输中发挥重要作用。本研究通过构建带有不同启动子(分别为Hsp70启动子,PsaD启动子,Arg7启动子)的三个表达载体,分别转化莱茵衣藻JUV,探讨不同启动子对葡萄糖转运蛋白基因的启动表达效果,并对转化株功能特性进行研究,结果显示转化株能够以葡萄糖为碳源进行异养生长,达到了初步改变莱茵衣藻营养模式的目的。具体结果如下:1)构建了pBR28-Glut1过表达载体、pDB124-CrGlut1过表达载体(CrGlut1基因:密码子优化后的葡萄糖转运蛋白基因)和pHR13-CrGlut1过表达载体,分别转入莱茵衣藻JUV中,筛选获得8株转化株;2)通过qRT-PCR检测转录水平的表达,Z1、Z2、Z4转化株中CrGlut1基因表达量相较于对照组分别均提高了114.69倍、127.43倍和120.91倍;H5、H9、H11转化株CrGlut1基因表达量相较于对照组别分别提高了14.18倍、25.66倍和77.24倍;A4、D1转化株Glut1基因表达量相较于对照组分别提高了8.53倍和7.32倍。结果表明三种转化株都能成功表达Glut1基因。3)通过qRT-PCR检测外源基因拷贝数,A4、D1转化株Glut1基因拷贝数分别为5和8;Z1、Z2、Z4转化株CrGlut1基因拷贝数分别为2、2和3;H5、H9、H11转化株Cr Glut1基因拷贝数分别为0.30、0.38以及0.36。4)通过Western Blot实验检测蛋白水平的表达,A4,D1转化株蛋白为55kDa,Z1、Z2、Z4转化株以及H5、H9、H11转化株蛋白为43 kDa,且Z1、Z2、Z4转化株Glut1蛋白表达量比H5、H9、H11转化株表达量更高。5)利用2-NBDG荧光标记法检测转化株对胞外葡萄糖的转运情况,结果表明,Z1、Z2、H9、H11转化株胞内2-NBDG含量比对照组分别提高了7.38倍、5.08倍、10.94倍和10.01倍。6)在光照条件下对转化株的功能特性进行初步探索,结果表明在额外添加葡萄糖作为补充碳源的条件下,转化株Z1、Z2、H9、H11生物量与对照组相比分别增加了26%、13%、25%和18%;以葡萄糖作为唯一碳源的条件下,转化株Z1、Z2、H9、H1生物量1分别增加了45%、55%、67%和73%;在黑暗条件及葡萄糖作为唯一碳源的条件下,转化株生物量有显著增长,而对照组的生物量几乎为零,其中转化株H9、H11生物量比Z1、Z生物量均高出约30%。结果表明,转化株在黑暗条件下能利用葡萄糖进行生长。综上所述,本研究通过将葡萄糖转运蛋白基因Glut1进行密码子偏好性优化并转入莱茵衣藻中表达,成功在莱茵衣藻中表达Glut1蛋白,初步改变了莱茵衣藻营养模式,使其能够利用葡萄糖作为碳源进行异养生长,并比较了三种启动子在莱茵衣藻核表达系统中表达能力的强弱,为进一步建立微藻生物反应器提供了可行性思路。