β地中海贫血和脊髓性肌萎缩是两种常见的单基因遗传病。其中β地中海贫血是是我国南方常见的一种常染色体隐性遗传、血红蛋白异常性疾病,携带率约为2.8%。该病由于珠蛋白基因缺失或突变导致。β珠蛋白基因簇位于人11号染色体上,包含5个功能基因和1个假基因,这些基因的突变导致血红蛋白合成异常而发病。全世界约发现200多种突变,我国大约有28种突变。地贫基因的突变会导致贫血及后续的器官损害,严重危害人的生命。SMA是一种常见的致死性常染色体隐性遗传性疾病,其发病率约1/6000-1/10000。人群携带率约1/40-1/50。染色体5q13的脊髓性肌萎缩运动神经元生存基因(survival motor neuron gene 1, smn1)的缺失是导致SMA发病的主要病因。Smn1基因的突变使脊髓运动神经元退变而导致肌无力和肌萎缩,由于肌肉渐进性的退化,患者走路、爬行、吞咽、甚至呼吸等功能都会逐渐丧失,常因呼吸衰竭而死亡。上面两种疾病至今仍缺乏有效的治疗方法。现在一般使用产前诊断的方法来减少患儿的出生。然而,产前诊断需要终止妊娠,给孕妇及家庭带来巨大的伤害。胚胎植入前诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是一种基于试管婴儿的技术发展起来的不同于产前诊断的诊断方法。PGD通过对体外授精形成胚胎进行细胞活检,使用PCR或者荧光原位杂交等技术,进行遗传病的诊断,根据结果移植合适的胚胎到宫腔中的一种技术,这种技术可以避免产前诊断所需要的终止妊娠。根据欧洲人类生殖与胚胎协会PGD分会的统计,目前全世界实行PGD周期总数超过20,000例,成功分娩6,000多个健康胎儿。为许多患者夫妇带来了希望。已经有许多对β地中海贫血和SMA进行植入前诊断的报道。如通过使用单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、荧光PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、巢式PCR、连锁分析结合微小测序等方法进行β地中海贫血的单细胞诊断和植入前诊断;通过限制性酶切、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR)、荧光PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、微小测序等方法进行SMA的植入前诊断。然而上述的方法都基于单细胞诊断技术,因此具有一些缺点,如只能同时扩增少量基因位点、样本不能保留、每种反应体系都需要进行优化、高等位基因脱扣率(allele drop out, ADO)等。为了解决这个问题,全基因组扩增技术(whole genome amplication, WGA)用于扩增单细胞全基因组DNA已经引入到PGD之中。WGA的方法有许多种,如引物延伸预扩增聚合酶链反应(primer extension preamplification PCR, PEP-PCR),简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR),多重链置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)等。PEP-PCR和DOP-PCR都是基于PCR为基础的,因此其具有基因组覆盖不完全高ADO率、扩增片段短不适用于需要高质量模板的后续基因分析方法等缺点。MDA是目前为止最好的WGA方法。其最早由Lizardi博士建立,主要基于Phi29 DNA聚合酶的恒温链置换扩增原理,具有恒温扩增、扩增片段长、基因组覆盖度高等优点。研究目的:本研究通过使用AS-PCR、微卫星分析、反向斑点杂交(reverse dot blot, RDB)比较不同MDA孵育时间对扩增成功率、ADO率影响,优化MDA的孵育时间。同时通过结合MDA、AS-PCR,微卫星分析对单细胞进行SMA诊断;结合MDA、RDB对β地中海贫血进行诊断,建立结合MDA对单细胞进行SMA和β地中海贫血诊断的方法,为日后建立SMA、β地中海贫血的植入前诊断平台打下基础。材料:取本研究所建立的5株成纤维细胞系做为研究材料。其中,有两株smn1基因纯合缺失成纤维细胞(S1和S2);1株β41-42/β17双重杂合突变β地中海贫血成纤维细胞(TH1);1株β41-42/β41-42纯合突变β地中海贫血成纤维细胞(TH2);1株正常人包皮成纤维细胞(N1)。这些细胞的突变类型均事先通过基因检测明确诊断。共取得49个单个成纤维细胞。其中包括13个TH1单个成纤维细胞,10个TH2单个成纤维细胞,8个S1单个成纤维细胞,10个S2单个成纤维细胞。8个N1单个成纤维细胞。方法:1.单个细胞制备2.将细胞分为16小时孵育组和4小时孵育组进行单细胞MDA扩增3.应用AS-PCR对MDA产物进行smn1和smn2基因的检测4.应用单重荧光PCR法对MDA产物扩增smn1基因紧密连锁的两个STR位点D5S351、D5S4355.应用RDB法对MDA产物进行β地中海贫血的18种β地贫突变位点的检测结果:1. MDA单个成纤维细胞的总扩增率89.3%(342/383),smn1基因的总扩增成功率为90.48%(19/21),smn2基因的扩增成功率为94.87% (37/39)。D5S351和D5S435的扩增成功率分别为94.87% (37/39),87.18% (34/39)。结合MDA、STR、AS-PCR对SMA进行PGD的总的扩增成功率为92.02%(127/138)。RDB检测扩增成功率为88% (220/250)。总ADO率是13.92%(11/79),D5S351的ADO率是16.22% (6/37),D5S435的ADO率是12.5%(2/16),结合MDA、STR、AS-PCR对SMA进行PGD的总ADO率为15.09%(8/53),RDB的ADO率是11.54%(3/26)。2. 16小时组与4小时组在扩增成功率方面分别为90.48% (171/189)和88.14% (171/194),结果无显著性差异(χ2检验,P>0.05);16小时组和4小时组的ADO率分别为17.07% (7/41)和10.53% (4/38),两者比较结果无显著性差异(χ2检验,P>0.05)。结论:1.本研究通过比较不同MDA孵育间对扩增成功率、ADO率的影响。使MDA的孵育时间降低到4个小时。使整个单细胞基因诊断时间缩短。为日后运用于植入前诊断创造了有利的条件。2.首次使用结合MDA、等位基因特异性PCR和STR分析的方法对单细胞SMA进行诊断。该方法可以诊断出smn1基因纯合缺失的患者。为SMA的植入前诊断奠定基础。3.首次使用MDA结合RDB技术对单细胞β地中海贫血进行诊断。该方法可以对单细胞同时检测18个β地中海贫血的突变位点。为β地中海贫血的植入前诊断奠定基础。