随着单细胞、微量核酸测序研究的发展,传统的样本编码方式已经难以应对大量样本的标记需求。同时,常规建库方法需要对每个样本逐一进行建库,面对大规模样本时耗时耗力,限制了在大规模并行测序中的应用。作为微流控技术的重要分支,液滴微流控为大规模标记建库提供了新的可能,通过“油包水”结构,液滴微流控技术将不同的样本分隔在不同的液滴中,结合液滴加样等操纵手段,达成独立反应的目的。目前,基于液滴微流控的高通量基因组编码测序技术多采用随机N碱基条形码编码,该方法尽管提高了通量,但却可能因GC含量不当、易形成二级结构等原因干扰测序质量,导致解码偏差;未知的条形码增加了解码时的难度,发生碱基错配后难以校正。针对上述问题,本课题采用液滴二维核酸编码技术,开发了一种基于液滴微流控平台的高通量、易解码的样品编码方式,可应用于大规模样本的并行测序。本课题的主要研究内容如下:1.发展“拉链型”液滴核酸二维码组合配对融合方法本课题采用的样本编码方案,从两个维度对样本进行标记,通过双端固定序列条形码的随机组合提高编码容量,双端编码液滴的配对融合效率是本课题的关键技术环节。基于液滴微流控,发展了“拉链型”条形码液滴配对融合方案,使双端接头液滴交错排列并两两融合。基于荧光成像以及通液过程中大量液滴图像统计结果表明,条形码液滴配对融合成功率达53%,剔除未编码液滴、单一编码液滴等无效液滴后,准确二维编码的液滴在全部有效液滴中的占比达97%。2.构建微液滴条件下的转座酶建库流程本课题采用自搭建的转座酶建库流程,将全长接头封装于转座酶内,简化了流程,使液滴内反应条件温和,避免了液滴PCR导致的破乳与错配问题。流程包括接头封装、片段化、缺刻平移与PCR富集、片段大小筛选四个步骤,并针对流程关键要素模板量、Mg2+浓度、片段化方法和PCR起始量进行了优化探究,改善了文库长度。基于琼脂糖凝胶电泳检测、克隆测序、二代测序等三个方面的结果证明,本方案可靠易行。本流程的液滴反应破乳率仅为0.824%,在相同条件下,较基于PCR的方案下降38倍。3.液滴二维码并行测序及分析流程的构建将液滴核酸二维码组合配对融合与转座酶建库流程结合,进行液滴二维编码并行测序,根据二维编码特性建立数据归一化方法,构建用于液滴二维码并行测序的数据分析流程。运用本方案标记GM12878细胞系DNA的全基因组扩增产物,测序结果表明,所有的二维条形码组合均可有效进行样本标记,且经过编码数据归一化后,各二维码编码的数据量离散程度小,标准差为0.06,为两种基于单端归一化数据量标准差的（基于i7）、（基于i5）。与基于离心管并行编码测序数据的比较表明,液滴二维样本编码流程的基因组覆盖度均一性更好且GC含量下降2.3个百分点,可在一定程度上改善转座酶对GC含量高的区段的偏好。