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目的:本研究构建并筛选有效抑制同源盒基因B4(homeoboxgene,HOXB4)的重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA,探讨靶向沉默HOXB4基因对K562/ADM细胞多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的影响及其机制。方法:1.设计合成4对针对HOXB4基因不同位点的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)序列,然后构建真核表达载体,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-HOXB4shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3,shRNA-4,真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3,shRNA-4经酶切和测序鉴定后,转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR、RT-qPCR、Western blotting检测HOXB4 mRNA及蛋白表达,筛选出沉默HOXB4效果最佳的干扰质粒载体。2.筛选出的 HOXB4 shRNA-3 稳定转染 K562/ADM 细胞,RT-PCR、Western blotting 检测 HOXB4 mRNA 及蛋白表达。Cell Counting kit-8(CCK-8)法测定细胞对阿霉素(Adriamycin,ADM)、依托泊苷、长春新碱、阿糖胞苷敏感性的影响,流式细胞术测定胞内ADM、罗丹明-123(Rhodamine-123,Rh-123)和5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀亚胺酯(5(6)-carboxy fluorescein diacetate,CFDA)平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI),RT-PCR 和 Western blotting 检测 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、多药耐药相关蛋白 1(multi-drug resistant associated protein 1,MRP1)的表达量变化,Western blotting方法分析PI3K/Akt通路相关蛋白表达变化。结果:1.成功构建4对pGPU6/GFP/Neo-HOXB4重组质粒载体,筛选出高效抑制HOXB4表达的shRNA-3,转染Hela细胞48h后,HOXB4 mRNA及蛋白的相对表达量分别为(25.13±4.45)%和(18.74±1.02)%,显著低于shRNA-1,-2,-4组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA-3 在 K562/ADM 细胞中稳定表达,HOXB4mRNA及蛋白相对表达量分别为(44.23±5.21)%和(34.97±5.81)%;3.靶向抑制HOXB4基因对ADM、依托泊苷、长春新碱、阿糖孢苷逆转耐药倍数分别为5.24、2.06、1.81、1.96;与对照组相比,HOXB4干扰组胞内ADM、Rh-123和CFDA MFI显著升高,增加倍数分别为2.07、3.59和1.66;4.靶向沉默HOXB4基因组K562/ADM细胞P-gp、MRP1、BCRP和PI3K/Akt通路相关蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论:1、成功构建靶向沉默HOXB4的重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA-1,-2,-3,-4,筛选出高效沉默HOXB4的重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA-3。2、pGPU6/GFP/Neo-HOXB4 shRNA-3 稳定转染 K562/ADM 细胞后能在mRNA及蛋白水平有效抑制HOXB4基因表达。3、靶向干扰HOXB4基因的表达能显著增加K562/ADM细胞对ADM、依托泊苷、长春新碱、阿糖孢苷的敏感性;干扰HOXB4后胞内ADM、Rh-123和CFDA蓄积增加且P-gp、MRP1、BCRP表达显著降低;靶向沉默HOXB4基因可抑制P-gp、MRP1、BCRP表达,增加K562/ADM细胞胞内化疗药物蓄积浓度,进而增强各化疗药物的细胞毒作用,K562/ADM细胞的MDR被逆转。4、靶向干扰HOXB4基因的表达能显著降低PI3K/Akt通路相关蛋白的表达,说明沉默HOXB4基因的表达对K562/ADM细胞MDR的逆转可能是PI3K/Akt通路介导的。