子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)简称内异症，以子宫内膜组织异位到子宫腔以外的部位为特征，是育龄妇女的常见病，其发病率高达15%。临床上内异症与不育关系极为密切，内异症患者中约30%～50%合并不育，而20%～50%不育症妇女患有内异症。随着研究深入，学者发现内异症对生殖力的损害是多方面的，除了造成盆腔粘连及输卵管梗阻等解剖学改变外，内异症患者生殖道局部微环境及内分泌异常，卵泡发育潜能降低、颗粒细胞凋亡增加、卵母细胞质量差也是导致其不育的重要原因。目前，国内外学者正在竭力探寻引起这些改变的理化因素，以期解答内异症妇女低生育力之谜。卵泡是女性生殖的基本单位，卵丘颗粒细胞与卵母细胞形成缝隙连接，进行细胞间信息传递和物质能量交换。卵丘颗粒细胞在卵母细胞发育和成熟过程中发挥着极其重要的调节作用，其状态可作为衡量卵母细胞质量、受精能力乃至胚胎发育潜能的一个重要参考指标。此外，颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的直接诱导因素，而内异症患者卵泡发育异常，卵泡期延长，卵泡生长速度明显减缓，优势卵泡缩小，同时伴有较多空卵泡及闭锁卵泡出现，这可能与其颗粒细胞凋亡率显著增高密切相关。因此，对内异症患者卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡情况开展研究显得十分必要。PGE2是具有多种生物活性的二十碳脂肪酸，广泛存在于人类、哺乳动物组织和体液中，与炎症、免疫、肿瘤等重要病生理过程有关。异位内膜高表达COX-2，使得内异症患者血清和腹腔液中PGE2浓度显著升高，而PGE2通过促进新生血管形成、抑制细胞凋亡、刺激雌激素合成等途径促进内异症发生发展。PGE2在卵巢局部可由颗粒细胞大量合成，通过旁分泌及自分泌方式而发挥作用。目前比较明确PGE2与卵子的成熟、排卵的发生及黄体的维持有关，然而PGE2对人黄素化颗粒细胞增殖及凋亡的调节作用尚不十分清楚。因此，探讨作为内异症致病关键因子及生殖功能调控因子的PGE2对颗粒细胞增殖与凋亡的影响，是研究内异症不育患者卵巢功能异常的一个极好的切入点。基于上述，本研究第一部分自接受IVF治疗的输卵管不育患者卵泡液中分离黄素化颗粒细胞，采用Real-time PCR、In-cell Western及MTT法检测PGE2对颗粒细胞survivin、caspase-3mRNA和蛋白表达，以及细胞增殖率的影响，探讨PGE2对颗粒细胞增殖与凋亡的调控作用机制；第二部分则在前部分研究的基础上，进一步了解内异症患者颗粒细胞survivin、caspase-3mRNA及蛋白表达的改变，并检测PGE2对内异症患者颗粒细胞survivin、caspase-3mRNA及蛋白表达的影响，以期探讨内异症患者颗粒细胞功能状态及凋亡增加原因，为阐明内异症患者低生育能力提供理论依据。第一部分PGE2对人黄素化颗粒细胞survivin、caspase-3表达的影响目的：检测PGE2对人黄素化颗粒细胞survivin、caspase-3表达的影响，探讨PGE2对颗粒细胞增殖与凋亡的调控机制。方法：收集因输卵管因素不育而接受IVF治疗患者卵巢黄素化颗粒细胞，预培养48小时后分组，用50ng/ml PGE2分别处理人黄素化颗粒细胞0h、6h、12h和24h；0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和250ng/ml PGE2处理人黄素化颗粒细胞的干预时间根据上述结果所得时间效应而定，采用Real-time PCR、In-cell Western方法检测颗粒细胞survivin、caspase-3mRNA及蛋白表达的变化；采用MTT比色法检测不同浓度PGE2对颗粒细胞增殖率的影响。结果：以0h为对照组，50ng/ml PGE2干预人颗粒细胞12h以内，survivin mRNA及蛋白表达明显上调，同时caspase-3mRNA及蛋白表达显著下调（P<0.05）；以作用时间6h最为显著，此时survivin mRNA表达升至最高，约为对照组6倍（P<0.05），而caspase-3mRNA及蛋白表达水平降至最低，分别为对照组0.56倍、0.71倍（P<0.05）；随着作用时间延长，PGE2作用逐渐减弱，PGE2干预颗粒细胞24h，survivin及caspase-3表达水平接近对照组，组间差异无统计学意义（P>0.05）。以0ng/ml为对照组，PGE2各浓度组干预颗粒细胞6h后，均可刺激颗粒细胞内survivinmRNA及蛋白表达，抑制caspase-3mRNA及蛋白表达，吸光度值A492值增加，细胞增殖率上升，呈浓度依赖型；且以PGE2浓度超过50ng/ml作用显著，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；而且颗粒细胞内caspase-3与survivin蛋白表达情况呈明显负相关（r=-0.991，P=0.009）。结论：PGE2以浓度依赖方式促进人黄素化颗粒细胞survivin mRNA及蛋白表达，同时抑制caspase-3mRNA及蛋白的表达，增强细胞生长活力，表明PGE2在调控人黄素化颗粒细胞增殖与凋亡过程中可能发挥着重要作用。第二部分PGE2对子宫内膜异位症患者黄素化颗粒细胞survivin、caspase-3表达的影响目的：检测PGE2对内异症患者黄素化颗粒细胞survivin、caspase-3的表达影响，以了解内异症不育患者的颗粒细胞功能状态及PGE2对内异症患者颗粒细胞增殖与凋亡的调控作用。方法：选择接受IVF治疗的内异症不育患者及输卵管因素不育患者各20例，自卵泡液中收集颗粒细胞，预培养48小时后分组，分为对照组，PGE2组，内异症组及内异症+PGE2组，PGE2组的浓度为50ng/ml，作用6h后终止反应，采用Real-time PCR、In-cell Western检测颗粒细胞survivin、caspase-3mRNA及蛋白表达的变化。结果：内异症组颗粒细胞基础状态及PGE2刺激后survivin mRNA及蛋白的表达均低于对照组，caspase-3表达与之相反（P<0.05）。50ng/ml PGE2干预颗粒细胞6h后，对照组survivin mRNA及蛋白表达量分别升高到基础状态表达量的1.7倍和1.5倍，差异有统计学意义（P<0.05）；而内异症组survivin mRNA及蛋白表达量虽有所增加，分别升高至其基础状态表达量的1.4倍和1.1倍，但差异无统计学意义(P>0.05)。基础状态下caspase-3mRNA及蛋白表达量在内异症组分别为（1.35±0.26，8.35±0.26），明显高于对照组表达量（1±0，5.35±1.29）（P<0.05）。50ng/ml PGE2作用颗粒细胞6h后，对照组caspase-3mRNA及蛋白表达量分别下降了46%和39%，差异有统计学意义（P<0.05）；而内异症组caspase-3mRNA及蛋白表达量仅下降了19%和17%，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：内异症患者颗粒细胞凋亡相关的基因表达异常，基础状态下凋亡抑制基因survivin低表达，凋亡诱导基因caspase-3高表达，这可能是内异症患者颗粒细胞凋亡的易感性增加、细胞凋亡率增加的根源之一；PGE2刺激后，内异症患者颗粒细胞survivin及caspase-3表达虽有所变化，但作用明显减弱，提示PGE2对内异症颗粒细胞增殖与凋亡的调控机制可能存在障碍，具体机制有待于进一步研究阐明。综上所述，本研究结果表明：⑴PGE2以浓度依赖方式上调颗粒细胞内凋亡抑制基因survivin mRNA及蛋白表达，同时抑制凋亡诱导基因caspase-3mRNA及蛋白表达，促进颗粒细胞增殖，表明PGE2在调控人颗粒细胞增殖与凋亡过程中可能发挥重要作用；⑵内异症患者颗粒细胞凋亡相关的基因表达异常，基础状态下凋亡抑制基因survivin低表达，凋亡诱导基因caspase-3高表达，这可能是内异症患者颗粒细胞凋亡的易感性增加、细胞凋亡率增加的根源之一；⑶PGE2刺激后，内异症患者颗粒细胞survivin及caspase-3表达虽有所变化，但作用明显减弱，提示PGE2对内异症颗粒细胞增殖与凋亡的调控机制可能存在障碍，具体机制有待于进一步研究阐明。