嗜盐四联球菌CICC10469(Tetragenococcus halophilus)是本实验室在酱油酿造中分离得到的一株中度嗜盐菌,能够在12-18%的盐浓度下产生氨基酸等物质。本论文针对嗜盐四联球菌的耐盐相关基因butA的结构预测和表达等方面进行分析。首先是利用生物信息软件和在线工具分析ButA蛋白。通过PSI-BLAST分析ButA蛋白的氨基酸序列,初步推断其为BCCT家族的一个转运透过酶。比较PROSITE和DNAMAN的多重序列比对的结果发现358-367的位置有一个特征模体。运用MEGA 6.0建立系统进化发育树,为研究ButA蛋白的比较进化及其他性质的研究提供参考。Prot Param分析ButA蛋白的理化性质,Prot Scale分析表明ButA蛋白具有多处疏水性肽链,TMHMM分析ButA蛋白预测得出12个跨膜区域,COILS和PSIPRED预测肽链的无规卷曲,为研究ButA蛋白如何转运甘氨酸甜菜碱,进而探究其耐盐机制提供了基础理论。本论文运用实时相对荧光定量的技术,分析不同盐浓度下生长的嗜盐四联球菌butA基因的转录水平,结果表明Na~+可以调控butA基因的表达。在高渗环境(>1M)下,butA基因的转录水平随着Na~+浓度的增大而增大;在低渗环境(<1M)下,butA基因的转录水平随着Na~+浓度的增大先增大再减小。再采用非离子去污剂Triton X-114提取嗜盐四联球菌的膜蛋白,SDS-PAGE显示与荧光定量一致的结果。碘结晶沉淀法测量嗜盐四联球菌在不同盐浓度下胞内甘氨酸甜菜碱(GB)的含量,发现无论是在高渗还是低渗环境下,胞内甘氨酸甜菜碱的累积量随着Na~+浓度的增大而增大。同时,我们克隆得到butA基因,构建质粒载体pET32a(+)–butA,转化到大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导蛋白大量表达。再应用HIS标签纯化目的蛋白,先是通过AKTA Explorer 100/10蛋白纯化系统以梯度洗脱的方式,确定以68 m M咪唑浓度(10%Buffer B)的洗脱效果最佳。再利用His Trap HP重力柱,用含68 m M咪唑的Elution Buffer来集中洗脱得到大量的纯化蛋白。最后通过碘结晶沉淀法来验证胞内甘氨酸甜菜碱的含量。结果表明不论是否存在高渗胁迫,异源表达的But A蛋白均提高了E.coli BL21-pET32a(+)–butA从外界运载甘氨酸甜菜碱的能力。