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疫苗接种的原则在于产生针对抗原的保护性免疫应答,且疫苗本身是安全的。传统的减毒疫苗存在毒力回复的潜在风险和全病原体疫苗的低免疫反应限制了其应用。与传统疫苗相比,新型疫苗的安全性高,特异型强,但普遍存在免疫原性低的缺点。因此需要免疫佐剂的加入以充分发挥疫苗的功能。细菌菌影(Bacterial Ghost,BG)是革兰阴性菌通过噬菌体PhiX174裂解基因E的诱导形成不含核酸、核糖体等胞质内容物的细菌空壳。细菌菌影保留了天然细菌完整的外膜结构,含有天然的免疫刺激剂,可以作为天然的免疫佐剂。肿瘤一直威胁着人类健康,由于发病率和死亡率均较高,因此对肿瘤的发生机制和免疫学的研究有利于开发出有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学的不断进步,利用免疫系统的力量和特异性免疫治疗已成为肿瘤疫苗研究的重点。有效的肿瘤疫苗应增强体液免疫应答和细胞免疫应答来抑制肿瘤的生长。由于可溶性抗原引起低抗体滴度或无效的CTL反应,所以肿瘤疫苗需要佐剂的加入以发挥有效功能。本文旨在利用沙门菌菌影(SEG)的天然佐剂作用联合OVA抗原,评价其对抗原提呈细胞的免疫增强作用,并在细胞水平和动物水平上进一步考察SEG在启动体液免疫应答和细胞免疫应答中的作用。为促进临床疫苗佐剂及肿瘤免疫治疗的发展和进步提供思路。研究内容包括以下三部分:一、沙门菌菌影作为佐剂体外免疫功能的研究将重组沙门菌HA2-EBOX进行诱导制备出沙门菌菌影SEG。用透射电镜对SEG进行形态学观察。结果显示,诱导后的重组沙门菌内容物流出形成空壳结构,提示沙门菌菌影SEG成功制备。将SEG联合OVA与BMDC孵育48h后,流式检测BMDC表面分子CD86、CD80、CD40和MHC-Ⅱ的表达,间接ELISA检测BMDC上清中的细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的分泌。同时,不同剂量的SEG联合OVA-FITC抗原与BMDC共孵育,不同时间点检测BMDC对抗原的摄取情况。结果显示,BMDC经SEG-OVA刺激后,高表达表面成熟分子 CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ,高分泌细胞因子 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α。BMDC对抗原OVA的摄取量随着SEG剂量的增加而增加。同时,为了明确SEG在获得性免疫应答阶段所发挥的作用,检测其是否能够促进CD4+T细胞应答和诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答。我们选用转基因小鼠OT-Ⅱ的CD4+T细胞和OT-I小鼠脾细胞分别与SEG刺激活化后的BMDC共孵育。结果显示,SEG不仅能够促进BMDC将抗原提呈给CD4+T细胞,同时将抗原交叉提呈给CD8+T细胞。二、SEG联合OVA诱导小鼠免疫应答的特性研究将不同剂量的SEG分别与BMDC和鼠巨噬细胞系RAW264.7孵育,CCK-8检测其安全性。同时,以一定剂量SEG免疫小鼠,观察小鼠两周内的生存状态。将48只6周龄左右BALB/c小鼠,随机分为6组:不同剂量的SEG联合OVA组(SEG分别为105、106、107CFU)、OVA组、SEG(107CFU)组和PBS对照组,其中OVA为50μg/只。通过皮下注射免疫接种。间接ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平,流式检测小鼠脾脏和外周血中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞频率变化。结果表明,与单独的OVA组相比,SEG-OVA免疫组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平均明显提高,脾脏和外周血CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞频率上调。SEG作为载体包裹OVA(SEG(OVA))免疫小鼠后,胞内染色检测脾脏CD4+T细胞亚群细胞因子IL-4、IFN-y分泌情况。结果表明,与对照组相比,SEG(OVA)免疫组脾脏CD4+T细胞胞内高分泌IFN-y,小鼠脾细胞增殖明显。三、SEG作为免疫佐剂对皮下黑色素瘤的抑制作用在预防肿瘤模型中,我们将6周龄BALB/c小鼠随机分为8组,每组10只,以铝佐剂(Alum)作为阳性对照,SEG组和PBS组作为阴性对照,实验组分别为:OVA组、SEG(OVA)组和 SEG-OVA 组(SEG 分别为 105、106、107CFU)。OVA 为 50μg/只。皮下免疫小鼠,在免疫后第7天,将黑色素瘤细胞B16-OVA制备成细胞悬液注射于小鼠右前肢皮下。肿瘤接种12天后,游标卡尺检测肿瘤大小,在第24天,处死小鼠,分离黑色素瘤。收集小鼠脾细胞,流式检测CD11b+Gr-1+细胞比例。结果显示,SEG作为免疫佐剂能够明显抑制小鼠肿瘤的生长。在治疗肿瘤模型中,我们用B16-OVA皮下接种小鼠,在接种后第7天,将小鼠分组并分别进行免疫:OVA组、SEG(OVA)组和SEG-OVA组(SEG分别为105、106、107CFU),OVA为50μg/只,同时以黑色素瘤(B16F10)作为阴性对照,检测SEG-OVA的特异性。收集小鼠脾细胞,流式检测CD11b+Gr-1+细胞比例。结果显示,SEG-OVA成功延缓了肿瘤的生长速度,且具有较好的特异性。