原发性胆汁性肝硬化证型分析及气虚血瘀证特异性miRNA研究

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目的:对原发性胆汁性肝硬化(PBC)进行临床证型分析,并对6例原发性胆汁性肝硬化(PBC)气虚血瘀证患者外周血进行Agilent芯片扫描筛选出PBC的差异miRNA,通过文献比对以及TargetScan,PITA,microRNAorg数据靶基因预测,寻找表达异常的相关miRNA,从而探究PBC的发病机制及中医辨证依据。  方法:通过文献阅读及相关疾病中医证型分型指南推荐,结合临床症状,对60例PBC患者进行临床证型比较,分析临床出现较多的证型及症状。以抗凝管抽取原发性胆汁性肝硬化气虚血瘀证及慢性乙型肝炎(CHB)患者各6例5ml血样,提取总RNA进行质检后,进行Agilent基因芯片扫描,找出43个差异性miRNA。通过对每个差异性miRNA在TargetScan,PITA,microRNAorg中检索及文献比对,挑选出7个miRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),新增健康对照组再次验证,初步探讨原发性胆汁性肝硬化气虚血瘀证患者TH1/TH2、雌激素代谢及胆管上皮细胞相关的miRNA表达情况。  结果:1.PBC患者临床证型中,气虚血瘀证15例(25%)、肝肾阴虚证10例(16.7%)、肝郁脾虚证9例(15%)、瘀血阻络证7例(11.7%)、肝胆湿热证6例(10%),兼证10例(16.7%),另2例(3.3%)无法归到任何证型,气虚血瘀证最多见。2.基因芯片筛选结果:通过Agilent基因芯片扫描PBC气虚血瘀证6例并设CHB对照,将表达差异的标准设置为FC值≥1.5,P值<0.05,发现两组miRNA表达有显著差异。在检测的miRNA谱中,有43个miRNA表达差异,其中hsa-miR-150-5p、hsa-miR-21-3p等9个miRNA表达上调,hsa-miR-1228-3p、hsa-miR-1238-3p等34个表达下调。3.验证基因的筛选:对基因芯片筛选的差异miRNA入库分析后进行文献比对,筛选出与TH1/TH2表达异常、雌激素代谢及胆管损伤相关的7个miRNA,分别为hsa-miR-150-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-223-3p。3.筛选出基因的验证:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),针对所筛选的7个miRNA,对PBC气虚血瘀证、HBC、正常人各6例再次验证,hsa-miR-148a-3p和hsa-miR-21-3p在PBC中均有上调(P<0.05)且与CHB、正常人比较均有差异(P<0.05);miR-125a-5p、miR-193a-3p,PBC与CHB对比在PBC中上调表达,二者间有差异(P<0.05),而PBC与正常组之间无差异(P>0.05);miR-150-5p在PBC、CHB中均上调(P<0.05),但PBC与CHB对比无差异(P>0.05);miR-193a-3p、miR-223-3p在各组间均无统计学差异(P>0.05)。  结论:PBC临床分型可能是气虚血瘀证、肝肾阴虚证、肝郁脾虚证、瘀血阻络证、肝胆湿热证,气虚血瘀证较为多见;miR-21-3p、miR-148a-3p可能是PBC气虚血瘀证特异性标志,推测诱导Th1/Th2的表达异常导致PBC的发病机制。
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