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乳腺癌几乎是所有国家女性最常见的癌症,已经成为中国女性中发病率最高的癌症。研究表明,CDK4和Cyclin D1在大约50%的乳腺癌细胞中存在过表达,与乳腺癌的发生发展及预后密切相关,抑制CDK4的活性将有助于乳腺癌的治疗,因此高效特异的靶向CDK4的乳腺癌治疗策略及机制的深入研究具有重要的科学意义。本课题组前期研究中,成功制备了核定位型抗CDK4胞内抗体NLS-AK3,通过体内外研究表明,NLS-AK3能在癌细胞中特异性结合内源的CDK4蛋白,并具有良好的抑瘤效应。通过差异蛋白质组学分析发现,MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞中抗CDK4胞内抗体NLS-AK3的表达,显著下调NPM1蛋白水平。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)是一种多功能蛋白,在多种肿瘤中均存在过度表达,促进癌细胞的增殖和转移。研究发现,NPM1可以直接结合Rb、FOXM1、NF-κB/p65、STAT3、c-myc等Cyclin D1/CDK4直接下游靶点,影响这些蛋白功能及其参与的细胞活动,促进肿瘤细胞的增殖和转移。为了确定核定位型抗CDK4胞内抗体NLS-AK3对三阴性乳腺癌细胞中NPM1表达及其相互作用因子的影响,本研究开展了Western blot、实时荧光定量PCR、GST pull down、免疫共沉淀等一系列实验分析,取得如下结果:(1)Western blot和Q-PCR结果表明,在MDA-MB-231细胞中胞内抗体NLS-AK3不仅下调NPM1蛋白水平,而且抑制NPM1的m RNA表达。(2)通过Gene MANIA网站预测CDK4与NPM1可能存在相互作用,之后通过间接免疫荧光实验,GST pull downa分析他们之间的联系。间接免疫荧光实验结果表明CDK4与NPM1在三阴性乳腺癌细胞的细胞核中共定位。利用亲和层析纯化法纯化GST-NPM1和GST蛋白,通过GST-NPM1对MDA-MB-231细胞核蛋白进行GST pull down分析,结果表明,NPM1与MDA-MB-231细胞中CDK4、Rb、磷酸化Rb、NF-κB/p65存在相互作用。(3)Western blot结果表明,MDA-MB-231细胞中NLS-AK3的表达,不影响Rb总蛋白水平,但降低磷酸化Rb水平,下调细胞核内NF-κB/p65水平。免疫共沉淀实验结果表明,在MDA-MB-231细胞核中胞内抗体NLS-AK3抑制NPM1与CDK4、Rb、磷酸化Rb、NF-κB/p65之间的相互作用。(4)通过Q-PCR检测了NLS-AK3对NF-κB/p65下游基因转录的影响。发现胞内抗体NLS-AK3下调E2F、CCNE1、CDK2、Cyclin A、CDC2、PCNA、c-myc,Bcl-2的m RNA水平,上调Bad的m RNA水平。上述研究结果表明,NLS-AK3可能通过抑制NPM1表达,抑制NPM1与CDK4、磷酸化Rb及NF-κB/p65相互作用,抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。本研究为阐释抗CDK4胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制提供了实验依据。