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三羟基雄甾烯酮(7α,15α-diOH-DHEA)是合成第四代口服避孕药Yasmin有效成分屈螺酮的关键中间体,Yasmin作为全球销量第一的避孕药使得7α,15α-diOH-DHEA的生产成为药物合成领域的研究热点之一。本实验室前期筛选到一株亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini)ST能双羟化去氢表雄酮(DHEA)生成7α,15α-diOH-DHEA。然而在其转化过程中,存在底物投料浓度低、菌株羟化能力弱及转化效率差等问题,很大程度制约了菌株C.lini ST在工业化生产中的进一步应用。因此,本论文以C.lini ST为出发菌株,采用基因组改组(genome shuffling)育种技术,筛选获得能高效转化DHEA合成7α,15α-di OH-DHEA的菌株,并对优势菌株羟化能力增强的原因进行初步探索。在此基础上,首次获得一个来源于丝状真菌C.lini中起着羟化DHEA作用的P450氧化酶并成功表达。具体结论总结如下:(1)选育了能高效转化DHEA制备7α,15α-diOH-DHEA的优势融合菌株。以C.lini ST为出发菌株,首先将高浓度乙醇作为筛选压力,利用等离子诱变(ARTP)技术选育了一株高产菌株C.lini ST-y9。进而将其与另一株实验室保藏的以高浓度DHEA为筛选压力诱变获得的高产菌株C.lini ST-0317作为genome shuffling育种的双亲本。经过三轮的genome shuffling,最终获得三株能高效双羟化DHEA生成7α,15α-diOH-DHEA的优势融合菌株。(2)简要评价了融合菌株的性能并初步探索了其羟化能力提高的原因。通过对优势融合菌株的5次传代培养发现C.lini ST-F307具有良好的遗传稳定性,该菌株在底物DHEA投料浓度为10 g·L-1时,目的产物7α,15α-diOH-DHEA的摩尔得率达到54.8%,较出发菌株C.lini ST(28.1%)提高了26.7%。随后优化了C.lini ST-F307的转化条件,当添加1.5%(v/v)的乙醇助溶时,能将底物DHEA的投料浓度提高至12 g·L-1,同时产物7α,15α-diOH-DHEA的摩尔得率提高至69.9%。由于甾体的羟化过程主要由P450酶系完成,因此分别测定了不同C.lini菌株(出发菌株C.lini ST、亲本菌株C.lini ST-0317、C.lini ST-y9和融合菌株C.lini ST-F307)粗酶液的P450酶活,结果表明C.lini ST-F307的P450酶活最高(45.2 U·mg-1)。进一步对各菌株中部分P450酶基因的转录水平进行了分析比较,发现相比于出发菌株和亲本菌株,融合菌株C.lini ST-F307的5个P450酶基因的转录水平均明显提高。由此可知P450酶的基因转录水平以及活性的提高导致了融合菌株C.lini ST-F307双羟化DHEA能力的增强。(3)扩增获得了C.lini ST-F307中起羟化DHEA作用的P450氧化酶,并对其进行了功能验证。由上述分析结果得知,C.lini ST-F307菌株中位于微粒体的一个P450氧化酶CYP3的基因转录水平最高,因此推测该P450氧化酶为羟化DHEA的一个关键酶。随后扩增出其完整的基因片段,经分析该蛋白属于CYP68J亚家族,命名为CYP68JX。进一步成功地将CYP68JX在毕赤酵母GS115体系中进行了外源表达,并利用重组酵母菌株进行了DHEA转化实验,结果表明:当底物DHEA的投料浓度为2 g·L-1时,重组表达菌株GS115-pPIC3.5K-cyp68jx的7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率达到31.8%,是GS115-pPIC3.5K(11.3%)的2.8倍,从而证明P450氧化酶CYP68JX具有双羟化DHEA的功能。