嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，为兼性细胞内寄生菌，可在巨噬细胞和肺泡上皮细胞内存活并繁殖，并能导致具有潜在致死性的社区获得性肺炎和医院获得性肺炎。凭借着在巨噬细胞内生长的特性，军团菌能够逃逸人类多形核白细胞的杀伤作用，从而逃逸机体免疫防御作用。各种抗菌药物对细胞膜的通透性存在差异性，使得军团菌在细胞外对诸如氨基糖苷和β内酰胺类抗菌药物很敏感，但这些药物对治疗军团菌是无效的。因此治疗军团菌感染的关键是选用能在吞噬细胞中达到有效抑菌浓度的抗菌药物。基于以往的回顾性研究，红霉素曾被推荐用以治疗军团菌感染，但用红霉素治疗的最大缺陷在于其疗程过长，以及其副作用(输液量大、静脉炎、胃肠道不适和耳毒性等)。近年来，有报道称氟喹诺酮类、新大环内酯类药物具有比红霉素更强的抗菌活性，更适合治疗军团菌感染且副作用更少。 Vilde等曾将抑制细胞内细菌生长的最低胞外药物浓度(MIEC)用作反映药物细胞内抗菌活性的一个指标。与细胞外的MIC测定相比，若要研究药物对细胞内嗜肺军团菌的抗菌活性(如MIEC)，现有的研究方法(如平板菌落计数法)大多费时费力，而若要同时进行多种药物的抗菌活性测定并对比其疗效之时，这些方法的缺点就更加明显。Higa F等曾报道过基于鼠类巨噬细胞(J774.1细胞系)的药物对细胞内军团菌抗菌活性的简化定量分析方法。该方法在其它细胞模型中(尤其是在人类细胞中)的应用情况，以及该方法应用于人鼠两种动物模型中试验结果有无差异至今未见报道。 在本研究中，我们提供了一种基于U937细胞模型的测定系统，可以对药物的细胞内抗军团菌活性进行快速、定量的分析。 材料和方法: 1.菌株：嗜肺军团菌ATCC 33 152(L pneumophila SGl)，由中山大学附属第三医院细菌室保存。 2.细胞：U937细胞(购自武汉，中国典型培养物保藏中心)为人组织淋巴瘤细胞，用90％RPMI-1640培养液(添加1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES、1.0mM丙酮酸钠)加上10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)为培养液，置于37℃含5％的CO2培养箱中培养。 3.主要试剂及抗菌药物：环丙沙星(北京，拜耳医药保健有限公司)，左氧氟沙星(北京，第一制药有限公司)，莫西沙星(北京，拜耳医药保健有限公司)，红霉素(北京，鼎国生物技术有限责任公司)，MTT(北京，鼎国生物技术有限责任公司)。 4.药物细胞外最低抑菌浓度(MIC)测定：采用E-test法和微稀释法测定，置37℃孵箱孵育48小时后观察MIC结果。 5.细胞病理效应(CPE)测定：通过MTT法测定感染军团菌后存活下来的U937细胞数目来反映细胞病理效应(CPE)，并求出CPED50。 6.药物细胞内最低抑菌浓度(MIEC)测定：采用MTT法测定各抗菌药物的细胞内抗菌活性。 7.统计分析：实验数据以均数±标准差来表示，实验组间差异用方差分析法进行统计，P<0.05视为差异有统计学意义。统计软件选用SPSS 11.5进行分析。 结果: 1.细胞内军团菌增殖情况测定：我们将嗜肺军团菌ATCC 33152置于以下三组不同培养介质中进行培养，A：含有U937细胞、10％胎牛血清的RPMI 1640培养液：B：含有U937细胞裂解产物、10％胎牛血清的RPMI 1640培养液；C：10％胎牛血清的RPMI 1640培养液。通过72小时的观察，我们发现随着时间的推移，A组中军团菌在细胞内大量复制增殖；B组中军团菌数目维持在一个相对稳定的水平上；C组中军团菌数目逐渐减少。这说明了单纯的培养液并不支持细菌的生长。 2.军团菌对U937细胞产生的细胞病理效应(CPE)：用MTT法检测72小时后存活下来的U937细胞，结果以其在OD 490nm处的吸光值来表示。结果显示：随着感染复数(MOI)的增大，被破坏的U937细胞逐渐增多，U937细胞的破坏程度和军团菌感染的剂量呈一定的比例关系，在以107/孔军团菌去感染时，被破坏的细胞数最多。CPEDso值为5×1 0s/孔。 3.细胞外抗菌活性MIC测定：分别采用E-test法和微稀释法测定实验所用药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的MIC值。E-test法结果：红霉素0.047μg/mL；环丙沙星0.38μg/mL、左氧氟沙星0.125μg/mL、莫西沙星0.125μg/mL；微稀释法结果：红霉素0.125μg/mL；环丙沙星0.03μg/mL、左氧氟沙星0.0161μg/mL、莫西沙星0.01 6μg/mL。 4.细胞内抗菌活性MIEC测定：我们采用1×105/孔(约20倍CPED50)去感染上述诱导成熟后的U937细胞(2×105个/孔)。结果如下：红霉素0.25μg/mL；环丙沙星0.016μg/mL、左氧氟沙星0.016μg/mL、莫西沙星0.004μg/mL。 结论: 1.军团菌ATCC 33152可在经佛波酯诱导48小时后的U937细胞内复制增殖，并能够导致细胞病变效应(CPE)，CPE的严重程度和感染复数(MOI)密切相关。 2.对于一些可在细胞内复制增殖的细菌如军团菌，除了测定药物对它的细胞外抗菌活性(MIC)之外，还需要测定其细胞内抗菌活性(MIEC)。 3.氟喹诺酮类抗菌药物在U937细胞模型中对军团菌具有很强的细胞内抗菌活性，效果要优于红霉素。其中莫西沙星的细胞内抗菌活性最强。 4.MTT法是一种行之有效的用于检测药物对细胞内军团菌抗菌活性的方法，可同时检测大批量药物样本的细胞内抗菌活性，拥有快速、简单、重复性好等优点。