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目的:胰腺癌是一种预后极差的致死性消化系统疾病,因其症状隐匿、发展迅速,胰腺癌患者往往难以得到早期诊断和及时治疗。由于人民物质生活水平的逐渐提高,胰腺癌的发病率与死亡率也有所上升。随着恶性肿瘤的个体化分子诊断和靶向治疗等新技术的兴起和发展,我们逐渐认识到胰腺癌早诊早治的关键在于针对疑似胰腺癌的患者进行分子标志物的检测和风险评估,在胰腺癌早期及时发现病变,明确诊断和分期,并监测患者相关基因及分子变化,制定个体化的靶向治疗方案。因此,阐明胰腺癌发生发展的分子机制对于突破胰腺癌诊治技术壁垒至关重要。近年来,竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）尤其是环状RNA（circular RNA,circRNA）影响疾病进程的相关研究受到广泛关注。circRNA是一类在真核细胞中广泛存在的非编码RNA,它具有共价键形成的闭合环状结构,缺少poly A尾巴,不易被核酸外切酶降解,相对于线性RNA具有更好的稳定性。circRNA可以作为吸附miRNA的“海绵”发挥ceRNA作用,解除miRNA对靶基因的抑制效应,从而间接影响靶基因的表达。多项研究已证明此类circRNA-miRNAmRNA调控网络与多种肿瘤的发生发展过程密切相关,可表现为对肿瘤各种生物学行为的促进或抑制作用。随着circRNA与胰腺癌相关研究的不断深入,研究者们逐渐认识到circRNA在胰腺癌发生发展过程中发挥重要调控作用,并且具有作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物和靶向治疗靶点的潜力。在本研究中,我们根据前期测序数据和生物信息学分析结果构建出胰腺中可能存在circRNA-miRNA-mRNA调控网络,并通过体外细胞功能实验和体内动物实验验证其在胰腺癌发展中的作用及其潜在机制。研究方法:本研究根据课题组既往测序结果选定了一个在胰腺癌组织中相对高表达的circRNA分子——hsa＿circ＿0002999作为研究目标,首先通过qRT-PCR验证hsa＿circ＿0002999在多种胰腺癌细胞系中高表达,利用Sanger测序方法确定其环状结构与环化位点,通过细胞爬片荧光原位杂交（FISH）实验确定其亚细胞定位主要在细胞质。然后利用生物信息学方法预测出下游结合的miRNA（hsa-miR-1270）以及靶基因（CORO2A）,并加以qRT-PCR实验验证,构建出hsa＿circ＿0002999—hsamiR-1270—CORO2A调控网络可影响胰腺癌发展进程的初步猜想。接下来,我们选取30对胰腺癌组织与对照胰腺组织的石蜡切片,并通过相对表达量与临床病理资料相关性研究来探究hsa＿circ＿0002999、hsa-miR-1270作为胰腺癌诊断标记物的潜能。此后,我们进行了体外细胞功能实验和体内动物实验以探究3个目标分子在胰腺癌发展过程中扮演的角色,并验证三者之间的特异性结合与相互作用,从而证实此circRNA-miRNA-mRNA调控网络在胰腺癌中的确实存在以及影响胰腺癌发展的作用机制。在Capan-2与Sw 1990 2株胰腺癌细胞系中分别过表达和敲减hsa＿circ＿0002999、hsa-miR-1270、CORO2A以及共转hsa＿circ＿0002999和hsa-miR-1270,通过细胞功能实验研究目标分子的转染对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等各项生物学功能的影响:采用CCK8法检测对胰腺癌细胞增殖的影响,通过细胞划痕实验观察其对胰腺癌细胞迁移的影响,通过Transwell实验观察其对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响,采用流式细胞术检测其对胰腺癌细胞凋亡的影响,通过Western Blot检测凋亡和侵袭相关蛋白Bax、Bcl2、MMP2、MMP9和Timp-1的表达变化;在293T工具细胞中利用双荧光素酶报告基因实验证明hsa＿circ＿0002999与hsa-miR-1270之间、hsa-miR-1270与CORO2A之间的特异性结合,通过qRT-PCR及Western Blot证实三者之间存在负反馈调节表达;通过体内裸鼠成瘤实验进一步证实hsa＿circ＿0002999—hsa-miR-1270调控网络对胰腺癌发展的作用。最后,我们进行CORO2A在胰腺癌中作用机制的生物信息学分析,根据预测结果采用Western Blot验证过表达和敲减CORO2A对间质-上皮转化相关标记物表达的影响。结果:1.hsa＿circ＿0002999是一种真实存在的、由BARD1基因2-7号外显子反向剪接而形成环状结构的circRNA,其亚细胞定位主要为细胞质,且在人胰腺癌细胞中的表达水平显著高于正常胰腺细胞。2.hsa＿circ＿0002999最可能特异性结合并海绵吸附的下游miRNA是hsa-miR-1270,且hsa-miR-1270在人胰腺癌细胞中的表达水平显著低于正常胰腺细胞。3.hsa-miR-1270最可能特异性结合并靶向抑制的下游mRNA是CORO2A,且CORO2A在人胰腺癌细胞中的表达水平显著高于正常胰腺细胞。4.hsa＿circ＿0002999在胰腺癌组织中的表达水平显著高于对照正常胰腺组织,且与肿瘤直径、临床分期、M分期及血管受侵显著相关。5.hsa-miR-1270在胰腺癌组织中的表达水平显著低于对照正常胰腺组织,且与肿瘤直径、T分期及血管受侵显著相关。6.CORO2A蛋白在胰腺癌组织中的表达水平显著高于对照正常胰腺组织,且生信分析提示CORO2A异常高表达的胰腺癌患者的总体生存率和无病生存率较低。7.在Capan-2与Sw 1990细胞中过表达hsa＿circ＿0002999可促进细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡,敲减hsa＿circ＿0002999对细胞各项生物学行为的影响与过表达相反。8.在Capan-2与Sw 1990细胞中过表达hsa-miR-1270可抑制细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡,敲减hsa-miR-1270对细胞各项生物学行为的影响与过表达相反。9.在Capan-2与Sw 1990细胞中过表达CORO2A可促进细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡,敲减CORO2A对细胞各项生物学行为的影响与过表达相反。10.在Capan-2与Sw 1990细胞中共转hsa＿circ＿0002999和hsa-miR-1270后发现二者之间存在负反馈调节,过表达hsa-miR-1270可以逆转过表达hsa＿circ＿0002999对胰腺癌细胞各项生物学功能的促进作用。11.hsa＿circ＿0002999、hsa-miR-1270及CORO2A之间两两之间存在特异性结合,且表达水平互相影响。12.CORO2A的过表达可以增强胰腺癌细胞的间质-上皮转化,并影响间质-上皮转化相关标记蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin及vimentin）的表达。13.在动物实验中,使用敲减hsa＿circ＿0002999或过表达hsa-miR-1270的Capan-2细胞种瘤发现肿瘤生长速度和显著减缓,肿瘤重量也明显减低;使用共转hsa＿circ＿0002999或过表达hsamiR-1270的Capan-2细胞种瘤时,肿瘤生长受抑制更加显著。结论:1.hsa＿circ＿0002999在人胰腺癌细胞及胰腺癌组织中的表达水平显著高于正常胰腺细胞及对照正常胰腺组织,且与肿瘤直径、临床分期、M分期及血管受侵显著相关。2.hsa-miR-1270在人胰腺癌细胞及胰腺癌组织中的表达水平显著低于正常胰腺细胞及对照正常胰腺组织,且与肿瘤直径、T分期及血管受侵显著相关。3.CORO2A在人胰腺癌细胞及胰腺癌组织中的表达水平显著高于正常胰腺细胞及对照正常胰腺组织,且生信分析提示CORO2A异常高表达的胰腺癌患者的总体生存率和无病生存率较低。4.在胰腺癌的发生发展中存在hsa＿circ＿0002999—hsamiR-1270—CORO2A互作调控网络,其中hsa＿circ＿0002999与CORO2A在胰腺癌中起到促癌作用,hsa-miR-1270在胰腺癌中起到抑癌作用,同时抑制hsa＿circ＿0002999和升高hsa-miR-1270可以延缓胰腺癌的发展并抑制胰腺癌的恶性生物学行为。靶基因CORO2A通过加强胰腺癌细胞的间质-上皮转化过程对胰腺癌的发展起到促进作用。此circRNA-miRNA-mRNA互作网络可能是胰腺癌治疗的潜在靶点。