研究目的艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的一种慢性传染病,主要传播途径包括血液接触,母婴传播和性传播三种,因其具有致命性,且尚无彻底治愈药物的特点,成为威胁人类健康的主要疾病之一。艾滋病未能得以根治的主要原因是有病毒储藏库的存在。目前的联合抗逆转录病毒治疗方法(cART)主要靶向艾滋病毒编码蛋白中的三种酶活性蛋白。但15种HIV编码蛋白中还有许多潜在的病毒机制及可能的药物靶点仍未得到充分研究。为了清除HIV-1的病毒储藏库,已经开发出各种治疗策略,其中包括“HIV-1病毒储藏库的震和杀”(“shock and kill”)。“shock and kill”研究的关键问题之一是如何修复HIV-1感染受损的免疫系统,恢复宿主的免疫监控,以达到清除病毒的效果。长期以来HIV-1的Nef蛋白可以通过介导细胞表面MHC-I的下调,帮助HIV-1逃避免疫系统的监控。寻找一种新型的特异性拮抗Nef下调MHC-1的抗病毒药物具有重大的学术价值和应用价值。本研究试图从FDA批准已经在临床上使用的化合物库中希望筛选一个能够特异性拮抗Nef蛋白的抗病毒药物,从而恢复细胞表面的MHC-I的表达,增加免疫系统对HIV-1感染细胞的应答反应,为临床上增强对HIV-1的免疫监控提供一种新的治疗策略。研究内容和方法首先,本研究利用分子克隆技术构建HIV-1 Nef-GFP蛋白稳定表达的荧光载体系统,通过细胞转染,流式细胞术等方法,在HEK293T细胞中验证Nef-GFP表达载体能够有效抑制细胞表面MHC-I的表达。进一步再通过高通量药物筛选,筛选出Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂洛伐他汀。其次,通过病毒的包装和体外扩增,过表达Nef和SERINC5,ELISA等实验方法,验证洛伐他汀是否能够抑制同样被Nef下调的CD4和SERINC5,并抑制由Nef引起的病毒复制能力。通过病毒体外感染,共培养等实验来检测洛伐他汀是否促进自体的细胞毒性T淋巴细胞通过免疫杀伤反应清除感染细胞,并进一步测试洛伐他汀抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4~+T淋巴细胞的病毒反弹,验证洛伐他汀的抗病毒效果。最后,通过分子对接实验、位点突变、和免疫共沉淀方法,探讨洛伐他汀特异性拮抗Nef蛋白恢复MHC-I表达的分子机制。研究成果本研究通过流式高通量药物筛选系统对FDA批准已在临床上广泛使用的的药物库进行药物筛选工作,我们发现一种他汀类药物洛伐他汀,不仅可以显著拮抗Nef蛋白下调MHC-I的表达,还可以拮抗Nef抑制的CD4和SERINC5的表达,并在野生型HIV-1病毒感染的CD4~+T细胞中验证了洛伐他汀对MHC-1和CD4的下调有抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性。体外CD4~+T细胞自体感染实验和自体CD8~+T细胞共培养实验中,加入特定组合的HIV-1抗原肽模拟体内病毒感染情况,发现洛伐他汀处理后,感染细胞中病毒复制被有效并持续的抑制,说明洛伐他汀能有效抑制病毒颗粒的内源性感染性。通过细胞杀伤实验检测结果,发现洛伐他汀处理后,感染的CD4~+T细胞的CTLs杀伤毒性显著增加,表明洛伐他汀还可以促进自体CTLs,并且有效抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4~+T淋巴细胞的病毒反弹。另外,我们通过分子对接实验,计算洛伐他汀可能与Nef-MHC-I复合物作用的位点,并通过分子突变实验加以证实。我们还发现洛伐他汀通过直接与Nef蛋白作用,干扰Nef-MHC-AP-1复合物的形成,从而抑制Nef蛋白对MHC-I的下调。结论本研究筛选出一种有前景的抗HIV-1病毒药物洛伐他汀。洛伐他汀可以拮抗Nef介导的MHC-I、CD4和SERINC5的下调,增强CD8~+T细胞的CTLs反应,抑制病毒的复制,有助于临床上增强抗HIV-1的免疫监控呼吸道合胞体病毒(RSV)是最常见的呼吸道病毒,它与儿童肺炎、细支气管炎和婴幼儿死亡率显著相关。Micro RNAs(mi RNAs)是一种内源性非编码小RNAs,在基因调控中发挥作用,并与宿主免疫反应和疾病进展相关。在本研究中,为了识别儿童肺炎相关潜在的生物标志物,同时研究RSV相关儿童肺炎的分子机制,我们分析了患RSV轻症肺炎和重症肺炎儿童全血样本的全转录组和微小RNA组。我们发现RSV重症肺炎患儿全血mi RNAs和编码RNA(m RNA)表达谱发生改变,差异明显。在RSV重症肺炎患儿中,hsa-mi R-1271-5p、hsa-mi R-10a-3p、hsa-mi R-125b-5p和hsa-mi R-30b-3p这四种mi RNAs被显著上调。进一步,我们对RSV重症肺炎的特异性mi RNA的靶标基因进行了比较。利用基因功能富集分析法(GO分析)对这些靶基因进行分析,发现大多数靶基因参与炎症和免疫反应,包括NF-k B信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路。我们的发现将有助于识别重症肺炎的生物标志物和新的药物设计策略,并用用以治疗的RSV重症肺炎儿童。