论文部分内容阅读
目的:探讨v MIP-ⅡN端肽(NT21MP)通过调控LncRNA SPRY4-IT1和GAS5抗乳腺癌的作用及分子机制。方法:1.qRT-PCR检测SPRY4-IT1和GAS5在人乳腺癌细胞株SKBR-3,MCF-7及过表达CXCR4的MDA-MB-231(pc DNA-CXCR4-MDA-MB-231)细胞中的表达差异;筛选SPRY4-IT1和GAS5的最佳干扰片段,鉴定SPRY4-IT1和GAS5过表达细胞株;2.qRT-PCR检测NT21MP和CXCR4对人乳腺癌细胞株中SPRY4-IT1和GAS5表达的影响;3.干扰及过表达SPRY4-IT1和GAS5,分别联合NT21MP,利用磺酰罗丹明(SRB)染色法检测细胞增殖能力;划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;4.qRT-PCR及Western blot检测干扰或过表达SPRY4-IT1和GAS5,对细胞周期和凋亡相关基因m RNA及蛋白水平表达的影响;5.qRT-PCR检测SPRY4-IT1调控蛋白SKA2在乳腺癌细胞株中的表达差异,干扰或过表达SPRY4-IT1对SKA2表达的影响;6.qRT-PCR及Western blot筛选SKA2的最佳干扰片段;7.干扰SKA2,并分别联合SPRY4-IT1干扰或过表达,或NT21MP后,利用SRB法检测细胞增殖能力;划痕实验及Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果:1.SPRY4-IT1在pc DNA-CXCR4-MDA-MB-231细胞中表达最高,在MCF-7细胞中表达最低;GAS5在MCF-7细胞中表达最高,在SKBR-3细胞中表达最低;SPRY4-IT1干扰片段3的干扰效果最好(p<0.05);2.NT21MP阻断SDF-1α的诱导作用,下调SPRY4-IT1的表达(p<0.05),上调GAS5的表达(p<0.05);干扰CXCR4下调SPRY4-IT1的表达(p<0.05),上调GAS5的表达(p<0.01);3.干扰SPRY4-IT1的表达,细胞的增殖、侵袭及转移能力下降,阻滞细胞周期于G0/G1期(p<0.05),促进细胞的凋亡(p<0.05),上调凋亡相关基因(Bak1、Caspase3)的表达,下调Bcl-2/Bax比值和周期调控分子(CyclinD1)的表达(p<0.05);过表达SPRY4-IT1,细胞的增殖、侵袭及转移能力增加,促进细胞周期从G0/G1期向S期转变,抑制细胞的凋亡(p<0.05),下调凋亡相关基因(Bak1、Caspase3)的表达,上调Bcl-2/Bax比值和周期调控分子(Cyclin D1)的表达(p<0.05);4.干扰GAS5的表达,细胞的增殖、侵袭及转移能力增加(p<0.01),促进细胞周期从G0/G1期向S期转变,抑制细胞的凋亡(p<0.05),下调凋亡相关基因(Bak1、Caspase3)的表达,上调Bcl-2/Bax比值和周期调控分子(Cyclin D1)的表达(p<0.05);过表达GAS5,细胞的增殖、侵袭及转移能力下降(p<0.05),阻滞细胞周期于G0/G1期,促进细胞的凋亡(p<0.05),上调凋亡相关基因(Bak1、Caspase3)的表达,下调Bcl-2/Bax比值和周期调控分子(Cyclin D1)的表达(p<0.05);5.相对于NT21MP和si-SPRY4-IT1单独处理组,联合作用对细胞的增殖、侵袭及转移抑制作用更显著,G0/G1期细胞数比例和凋亡细胞数比例增加更明显;反之,过表达SPRY4-IT1与NT21MP联合作用,细胞的增殖、侵袭及转移能力高于NT21MP组,但低于pc DNA-SPRY4-IT1组,G0/G1期比例和凋亡细胞数低于NT21MP组,但高于pc DNA-SPRY4-IT1组;6.干扰GAS5与NT21MP联合作用,细胞的增殖、侵袭及转移能力高于NT21MP组,但低于si-GAS5组,G0/G1期细胞数比例和凋亡细胞数比例低于NT21MP组,但高于si-GAS5组;而相对于NT21MP和pc DNA-GAS5单独处理组,联合作用对细胞的增殖、侵袭及转移抑制作用更明显,G0/G1期细胞数比例和凋亡细胞数比例增加更明显;7.SKA2在MCF-7细胞中表达最高,在SKBR-3细胞中表达最低;SKA2干扰片段1的干扰效果最好(p<0.01);干扰SPRY4-IT1下调SKA2的表达(p<0.05),过表达SPRY4-IT1则上调SKA2的表达(p<0.05);8.干扰SKA2表达后,细胞的增殖、侵袭及转移能力下降,阻滞细胞周期于G0/G1期(p<0.05),促进细胞的凋亡(p<0.01);联合干扰SKA2和SPRY4-IT1,细胞的增殖、侵袭及转移能力比单独处理组降低更明显,G0/G1期比例和凋亡细胞数增加更明显;9.干扰SKA2与过表达SPRY4-IT1联合作用后,细胞的增殖、侵袭及转移能力高于si-SKA2组,但低于pc DNA-SPRY4-IT1组,G0/G1期比例和凋亡细胞数低于si-SKA2组,但高于pc DNA-SPRY4-IT1组;10.干扰SKA2与NT21MP联合作用,细胞的增殖、侵袭及转移能力比单独处理组降低更明显,G0/G1期比例和凋亡细胞数增高。结论:1.LncRNA SPRY4-IT1和GAS5在乳腺癌细胞中分别发挥癌基因和抑癌基因的作用;2.NT21MP可通过下调SPRY4-IT1和上调GAS5的表达,发挥抗乳腺癌的作用;3.NT21MP的抗乳腺癌作用部分是通过SPRY4-IT1下游效应分子SKA2实现的。