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帕金森病(PD)是第二大最常见的神经退行性疾病，其发病率逐年增加，预计到2030年，其发病人数会增加到九百万。在临床上，该病主要表现为一系列与运动功能障碍相关的症状，包括运动迟缓、肌强直，静止性震颤等。随着年龄的增大，症状逐渐加重，最终会引起运动功能的完全丧失。其特征性的病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元的缺失以及路易小体(LBs)的出现。目前，其发病原因还不清楚，普遍认为其发病与环境毒物、基因突变，遗传因素以及老化等因素相关。帕金森病面临着早期诊断困难，晚期几乎不能治疗，神经退行性的进程不能逆转等挑战，给社会和家庭带来了巨大的经济负担。因此探究其发病机制，从而找到疾病的治疗靶点已成为帕金森病研究的热点。
红景天是研究最多的景天科多年生草本植物，在北极地区及欧洲和亚洲的山地生长，被称为“金根”。具有刺激神经、抗高原反应，抗疲劳以及抗抑郁等作用。红景天苷(salidroside，Sal)是从红景天中提取的活性成分，具有明显的抗氧化，抗衰老和抗疲劳等多种药理作用。我们课题组的前期研究发现Sal在PD模型中具有保护多巴胺能神经元的作用，但是其具体机制尚不清楚。本研究旨在探究Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在帕金森病模型中发挥保护多巴胺能神经元的作用，从而为临床帕金森病的防治提供实验依据。
【目的】
1.建立PD小鼠及细胞模型来分析Sal对PD模型的神经保护作用及其作用机制。
2.探究在PD模型中，Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路发挥神经保护作用。
【方法】
1.对C57BL/6小鼠连续腹腔注射MPTP(30 mg/kg)5天，构建PD小鼠模型。而后对小鼠连续腹腔注射Sal(15 mg/kg；50 mg/kg)7天，探究Sal的神经保护作用，并且设置Sal单独对照组(15 mg/kg；50 mg/kg)排除Sal本身的效用。通过爬杆实验及旷场实验分析Sal对小鼠行为学能力的影响；通过免疫荧光实验及高效液相色谱法分别测定黑质内TH-阳性神经元的数目及纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量来分析多巴胺神经元的损伤情况。通过不同浓度的MPP+分别作用于SH-SY5Y细胞和MN9D细胞，筛选出构建PD细胞模型的最佳浓度；通过MTT法分析Sal预处理对MPP+引起的细胞毒作用的影响。
2.为了探究Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在PD模型中发挥神经保护作用，首先测定了细胞及黑质内ROS、NO、iNOS，nNOS等与ROS/RNS相关的因子；进一步通过ELISA测定了脂质，蛋白质及DNA的氧化/氮化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，3-硝基酪氨酸(3-Nitrotyrosine，3-NT)及8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)的水平；通过ELISA及Westernblot测定了黑质内相关的抗氧化因子GSH、Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)，GSH-Px和CAT的含量；DJ-1和Nrf2是两个关键的抗氧化基因，通过Westernblot法测定了细胞及黑质内DJ-1和Nrf2的表达；通过ELISA测定了细胞及黑质内线粒体复合物Ⅰ(complexⅠ)的活性。
3.氧化/氮化应激和complexⅠ失活会形成一个恶性循环，最终引起多巴胺神经元死亡。通过小干扰RNA(siRNA)干扰DJ-1和Nrf2的表达以及ROS/RNS的特异性抑制剂作用于细胞分析Sal是否可以通过抑制氧化/氮化应激来维持complexⅠ活性从而发挥神经保护作用。
【结果】
1.在爬杆实验中，与对照组相比，MPTP组小鼠头完全朝下所需时间(T-turn)及小鼠爬到地面所用时间(T-LA)明显延长；与模型组相比，Sal治疗组其T-turn及T-LA明显缩短；在旷场实验中，与对照组小鼠相比，MPTP组小鼠在规定时间内的移动速度显著降低，而Sal治疗组与MPTP组相比，速度明显提高；免疫荧光实验结果表明：与对照组相比，模型组TH-阳性神经元的数目，多巴胺及其代谢产物的含量明显减少；而与模型组相比，Sal治疗组其TH-阳性神经元的数量，多巴胺及其代谢产物的含量明显增加。
2.MTT结果表明：1000μM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞24h，200μM的MPP+作用于MN9D细胞24h，细胞活力下降到对照组的50%左右，因此我们使用以上浓度分别作用于SH-SY5Y细胞和MN9D细胞构建PD体外细胞模型；10，25，50μMSal预处理MN9D细胞，10，20，40μMSal预处理SH-SY5Y细胞可以明显减轻MPP+引起的细胞损伤。
3.Sal处理可以明显减轻MPP+/MPTP引起的ROS、NO、iNOS、nNOS、MDA，3-NT及8-OHdG的增加，以及GSH、SOD1、SOD2，GSH-Px和CAT含量的降低。Westernblot结果表明：与MPP+/MPTP模型组相比，Sal可以明显增加DJ-1在细胞核及线粒体的累积以及Nrf2在细胞核的累积，明显抑制细胞质内Keap1的表达。ELISA结果表明：Sal可以明显减轻MPP+/MPTP引起的complexⅠ活性的降低。
4.siRNA干扰DJ-1和Nrf2的表达可以明显抵消Sal引起的complexⅠ活性及细胞活性增加的效用，而通过ROS/RNS的特异性抑制剂作用于细胞表现出与Sal类似的效应，说明Sal可能通过抑制氧化/氮化应激来维持complexⅠ活性从而发挥神经保护作用。
【结论】
1.Sal对MPTP/MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用。
2.在MPTP/MPP+诱导的PD模型中，Sal具有抑制氧化/氮化应激，增强complexⅠ活性的作用。
3.Sal可能通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在PD模型中发挥神经保护作用。
红景天是研究最多的景天科多年生草本植物，在北极地区及欧洲和亚洲的山地生长，被称为“金根”。具有刺激神经、抗高原反应，抗疲劳以及抗抑郁等作用。红景天苷(salidroside，Sal)是从红景天中提取的活性成分，具有明显的抗氧化，抗衰老和抗疲劳等多种药理作用。我们课题组的前期研究发现Sal在PD模型中具有保护多巴胺能神经元的作用，但是其具体机制尚不清楚。本研究旨在探究Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在帕金森病模型中发挥保护多巴胺能神经元的作用，从而为临床帕金森病的防治提供实验依据。
【目的】
1.建立PD小鼠及细胞模型来分析Sal对PD模型的神经保护作用及其作用机制。
2.探究在PD模型中，Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路发挥神经保护作用。
【方法】
1.对C57BL/6小鼠连续腹腔注射MPTP(30 mg/kg)5天，构建PD小鼠模型。而后对小鼠连续腹腔注射Sal(15 mg/kg；50 mg/kg)7天，探究Sal的神经保护作用，并且设置Sal单独对照组(15 mg/kg；50 mg/kg)排除Sal本身的效用。通过爬杆实验及旷场实验分析Sal对小鼠行为学能力的影响；通过免疫荧光实验及高效液相色谱法分别测定黑质内TH-阳性神经元的数目及纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量来分析多巴胺神经元的损伤情况。通过不同浓度的MPP+分别作用于SH-SY5Y细胞和MN9D细胞，筛选出构建PD细胞模型的最佳浓度；通过MTT法分析Sal预处理对MPP+引起的细胞毒作用的影响。
2.为了探究Sal是否可以通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在PD模型中发挥神经保护作用，首先测定了细胞及黑质内ROS、NO、iNOS，nNOS等与ROS/RNS相关的因子；进一步通过ELISA测定了脂质，蛋白质及DNA的氧化/氮化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，3-硝基酪氨酸(3-Nitrotyrosine，3-NT)及8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)的水平；通过ELISA及Westernblot测定了黑质内相关的抗氧化因子GSH、Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)，GSH-Px和CAT的含量；DJ-1和Nrf2是两个关键的抗氧化基因，通过Westernblot法测定了细胞及黑质内DJ-1和Nrf2的表达；通过ELISA测定了细胞及黑质内线粒体复合物Ⅰ(complexⅠ)的活性。
3.氧化/氮化应激和complexⅠ失活会形成一个恶性循环，最终引起多巴胺神经元死亡。通过小干扰RNA(siRNA)干扰DJ-1和Nrf2的表达以及ROS/RNS的特异性抑制剂作用于细胞分析Sal是否可以通过抑制氧化/氮化应激来维持complexⅠ活性从而发挥神经保护作用。
【结果】
1.在爬杆实验中，与对照组相比，MPTP组小鼠头完全朝下所需时间(T-turn)及小鼠爬到地面所用时间(T-LA)明显延长；与模型组相比，Sal治疗组其T-turn及T-LA明显缩短；在旷场实验中，与对照组小鼠相比，MPTP组小鼠在规定时间内的移动速度显著降低，而Sal治疗组与MPTP组相比，速度明显提高；免疫荧光实验结果表明：与对照组相比，模型组TH-阳性神经元的数目，多巴胺及其代谢产物的含量明显减少；而与模型组相比，Sal治疗组其TH-阳性神经元的数量，多巴胺及其代谢产物的含量明显增加。
2.MTT结果表明：1000μM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞24h，200μM的MPP+作用于MN9D细胞24h，细胞活力下降到对照组的50%左右，因此我们使用以上浓度分别作用于SH-SY5Y细胞和MN9D细胞构建PD体外细胞模型；10，25，50μMSal预处理MN9D细胞，10，20，40μMSal预处理SH-SY5Y细胞可以明显减轻MPP+引起的细胞损伤。
3.Sal处理可以明显减轻MPP+/MPTP引起的ROS、NO、iNOS、nNOS、MDA，3-NT及8-OHdG的增加，以及GSH、SOD1、SOD2，GSH-Px和CAT含量的降低。Westernblot结果表明：与MPP+/MPTP模型组相比，Sal可以明显增加DJ-1在细胞核及线粒体的累积以及Nrf2在细胞核的累积，明显抑制细胞质内Keap1的表达。ELISA结果表明：Sal可以明显减轻MPP+/MPTP引起的complexⅠ活性的降低。
4.siRNA干扰DJ-1和Nrf2的表达可以明显抵消Sal引起的complexⅠ活性及细胞活性增加的效用，而通过ROS/RNS的特异性抑制剂作用于细胞表现出与Sal类似的效应，说明Sal可能通过抑制氧化/氮化应激来维持complexⅠ活性从而发挥神经保护作用。
【结论】
1.Sal对MPTP/MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用。
2.在MPTP/MPP+诱导的PD模型中，Sal具有抑制氧化/氮化应激，增强complexⅠ活性的作用。
3.Sal可能通过调节ROS/RNS/ComplexⅠ通路在PD模型中发挥神经保护作用。