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植物细胞的生长发育受到多种信号因子的调控,其分子机制的揭示和阐明有助于深化对细胞信号转导领域的理解,也将极大克服制约我国农业、林业等应用领域发展的一些亟需解决的技术瓶颈。细胞快速碱化因子(Rapidalkalinizationfactor,RALF)作为一类植物界保守的多肽激素,因其能快速抑制质膜氢泵(PM-H+ATPase)活性导致细胞壁碱化从而抑制细胞伸长而得名。近来研究表明拟南芥中的蛋白激酶FERONIA(FER)作为RALF1多肽信号的受体可通过胞外域与RALF1直接结合来感受RALF1信号刺激并将该信号传递至细胞内,最终调控质膜的氢泵活性(PM-H+ATPase,e.g.AHA2)来控制细胞伸长,但响应RALF1配体信号的早期精细分子机制并不十分清楚。例如蛋白激酶FER受体接受RALF1信号刺激后,如何将RALF1信号传递至细胞内?是否存在一些下游成员,如胞质类受体激酶(RLCK)参与了该信号通路?如果存在,这些胞内的下游成员又以何种方式参与了该信号通路呢?因此深入研究能够与蛋白激酶FER直接相互作用的下游分子如胞质类受体激酶RLCK,并阐明其信号传导的分子机制将有助于我们揭示受体蛋白激酶FER接受、传递RALF1小肽信号并最终调控细胞生长的早期精细分子机制。本论文依据此研究思路开展了一系列的生化与遗传学实验,论文的具体研究结果如下:(1)利用质谱,酵母双杂交(Y2H),双荧光互补(BiFC),GST-pull down及Co-IP等多种分析蛋白相互作用的技术手段证明了 一个拟南芥的胞质类受体激酶(RLCK-RIPK)能够与FER受体蛋白激酶特异性的相互作用,且相互作用的强弱依赖于彼此的激酶活性。(2)遗传学表型分析表明RIPK突变后表现出与FER突变类似的遗传学表型,如根毛变短,根基酸化速率增强,植株形态及叶片变小,对生长素NAA不敏感而对ABA敏感等。表型回复实验表明将RIPK过表达入FER突变体fer-4植株中能够部分恢复FER的功能,证明FER与RIPK存在遗传上的上下游关系。(3)利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了融合GST标签的RIPK重组蛋白GST-RIPK,利用纯化的GST-RIPK重组蛋白作为抗原免疫小白鼠制备了特异性较好的RIPK多克隆抗体。以野生型Col.0和ripk突变体为材料,利用Western blot技术结合碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase;CIP)处理,证明了胞质类受体激酶RIPK在拟南芥体内存在两种形式,分子量介于70 kDa和55 kDa之间。一种为非磷酸化的形式,我们命名为RIPK;另一种为磷酸化的形式,我们命名为P-RIPK。(4)通过分析野生型Co1.0与ripk突变体中FER的磷酸化水平变化及野生型Co1.0与fer-4突变体中RIPK的磷酸化水平变化并结合FER激酶和RIPK激酶相互磷酸化的体外实验证明了 FER与RIPK的相互作用依赖促进彼此的磷酸化水平变化。(5)分析了 RIPK磷酸化水平的变化对RALF1小肽时间及浓度梯度的依赖性,结合RIPK突变体对RALF1小肽的响应情况证明了 RIPK直接响应RALF1小肽,且磷酸化水平受到RALF1小肽的调控。RIPK突变后降低了对RALF1小肽的敏感程度。(6)通过添加外源RALF1小肽诱导与否,利用双荧光互补(BiFC)及Co-IP等技术进一步证明了 FER与RIPK在细胞膜上的相互作用受RALF1小肽增强。此外我们利用酵母双杂交技术在单子叶模式植物水稻中也证明了 FER的同源蛋白OsFLR2与RIPK的同源蛋白OsRIPK-A存在相互作用。生物信息学及Q-PCR分析进一步证明了 RALF1,FER与RIPK在植物界比较保守且存在表达模式上的重叠,因此RALF1-FER-RIPK可能代表了植物界一种普遍的RALF1小肽信号传递模式。综上所述,本研究结果将极大丰富对RALF1-FER信号网络调节细胞伸长分子机制的理解。