原始生殖细胞到成熟配子的产生、受精合子全基因组重新启动是人和哺乳动物的生命周期中最为重要的两个阶段。已有研究对人及哺乳动物配子及早期胚胎全基因组甲基化位点进行定量分析,证实了人及哺乳动物成熟配子的产生、受精合子及种植前胚胎发育过程中DNA甲基化呈现动态变化,该甲基化动态变化图谱,对我们了解哺乳动物早期胚胎的基因表达及其调控和转座子抑制的功能相关性提供了重要理论依据：研究采用简化代表性亚硫酸氢盐测序法(Reduced representation bisulfite sequencing RRBS)可准确的区分5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,5-mC)及5-羟甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-hmC),并定量分析全基因组的甲基化水平,但该方法的覆盖率不够。为解决覆盖率不足的问题,乔杰等人采用改良的全基因组亚硫酸氢盐测序法(Whole genome bisulfite sequencing, WGBS)检测了囊胚内细胞团(ICM)和种植后胚胎全基因组甲基化水平,但配子及囊胚前期的胚胎全基因组甲基化位点变化情况未用覆盖率高的WGBS法检测。本研究采用半定量但几乎完全覆盖全基因组启动子和CpG岛甲基化芯片法(MeDIP-Chip)1分析人精子、卵母细胞及种植前胚胎各发育阶段全基因组CpG岛及启动子区域甲基化动态变化情况,以了解CpG岛及启动子甲基化的动态变化模式、该甲基化动态变化的可能调节机制及在早期胚胎发育过程中的功能。卵母细胞在第一次减数分裂中期(prophase I,M1)开始去甲基化,出生后在始基卵泡向窦卵泡发育过程中的次级卵母细胞的粗线后期重新建立甲基化模式,受精前完成。窦卵泡期取出未成熟卵,在体外进行24-48h的培养达成熟后可受精,但研究认为这个时间不足以让卵母细胞在成熟前完成甲基化的重建,而使在后期的胚胎发育过程中出现各种异常。从体外受精胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)患者小卵泡中得到的不成熟卵,进行体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)后获得的成熟卵受精后行胚胎移植可成功获得临床妊娠,但各研究中心妊娠率的比率相差甚远,有研究认为这部分未成熟卵来源的胚胎质量差、发育潜能低下,移植后妊娠率极低,而质疑其利用价值：由此看来对于促排卵患者中获得的未成熟卵是否有利用价值存在争议。因此,本研究通过对IVM来源的处于合子基因组启动活化的关键时期-细胞融合的桑椹胚,对比分析IVM与体内成熟(In vivo maturation IVO)来源桑椹胚全基因组CpG岛及启动子的甲基化水平,从表观遗传学的角度来评价IVM胚胎发育潜能低下的可能机制及安全性。第一部分人配子、种植前胚胎全基因组CpG岛及启动子区域甲基化动态变化图谱研究目的既往研究采用RRBS的方法证实了人及哺乳动物成熟配子的产生、受精合子及种植前胚胎发育过程中DNA甲基化呈现动态变化,但该方法覆盖率不够。本研究采用几乎完全覆盖启动子和CpG岛(大部分甲基化发生区域)甲基化芯片法(MeDIP-Chip)分析人精子、卵母细胞及种植前胚胎各发育阶段全基因组CpG岛及启动子区域甲基化动态变化情况,以了解CpG岛及启动子甲基化的动态变化模式、该甲基化动态变化的可能调节机制及在早期胚胎发育过程中的功能。研究方法经医院伦理委员会批准,收集2010年7月-2013年7月于广州医科大学附属第三医院生殖医学中心助孕的患者,卵母细胞来自助孕患者及自愿者捐赠,精子来自助孕患者,原核及2-4cell胚胎来自自愿者捐赠获得卵子受精后所得,其余早期胚胎来自助孕妊娠成功患者的捐赠,所有标本的使用得到了捐赠者的知情同意。分组标本按发育阶段分为8组,①精子组,标本30份；②MII期卵细胞组：25枚；③2PN期合子,25枚；④4细胞期胚胎,5枚；⑤8细胞期胚胎；4枚；⑥桑椹胚胚胎；6枚；⑦5枚囊胚的ICM(内细胞团)；⑧5枚囊胚的TE(滋养层细胞)。DNA的提取①精子采用差异裂解法,并结合使用Genomic DNA urification Kit(Promega)的试剂盒提取精子DNA；②-⑥组,卵及囊胚前期胚胎使用酸性Tyrode’s solution去除透明带及粘附的颗粒细胞,移入PCR管裂解细胞提取DNA；⑦和⑧囊胚的ICM(内细胞团细胞)与TE(滋养层细胞),用拉细的巴氏管钝性分离ICM与TE后,分别移入PCR管裂解细胞收集DNA。(3)甲基化芯片(MeDIP-Chip)各组DNA采用超声波将DNA碎裂成大小约200-1000 bp的随机片段,经鼠5-甲基单克隆抗体进行免疫沉淀、纯化后,采用Cy3和Cy5标记WGA试剂盒进行全基因组扩增,然后与包含了NimbleGen人DNA甲基化3x720k启动子和CpG岛的微阵列杂交,用GenePix 4000B微阵列扫描仪读取数据。(4)芯片甲基化数据的统计Peak Score:探针上峰值的-log 10 (P-value)值,反应甲基化程度(Cut off=2);PeakMvalue:探针测得峰值中位数值的log2 (IP/Input)-比值；n指Peak Score≥2的峰值数,或者每个PeakMvalue对应的峰值数。实验结果(1)提取DNA的纯度及免疫共沉淀所富集的DNA片段均符合实验要求。(2)人配子、种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化独特的动态变化模式①精子的全基因组CpG岛的甲基化程度最高(sperm, n=15604),受精后由原核期开始逐步去甲基化(2PN, n=3744),4cell期胚胎时全基因组CpG岛的甲基化程度达最低(4cell, n=2826),8cell胚胎期(8cell, n=3073)后CpG岛甲基化水平逐步恢复重建,桑椹胚期CpG岛甲基化水平进一步升高(Morula,n=5374)直至囊胚期ICM (ICM,n=5706)的CpG岛甲基化水平接近卵母细胞水平(Oocyte,n=6062),而TE细胞CpG岛甲基化水平处于卵母细胞与精子之间(TE,n=8376)。②种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化的动态变化主要区域在高甲基化(Peak Mvalue≥0.7)和低甲基化(Peak Mvalue≤0.4)区域。③种植前胚胎基因组CpG岛的甲基化程度的变化,存在三个剧烈变化期。这种变化的趋势为：第一期为精子、卵母细胞受精后到2PN的转变,即精子及卵母细胞甲基化程度降低(迅速去甲基化)；第二期：桑椹胚到囊胚期的转变,甲基化的迅速重建,第三期囊胚形成过程中细胞向ICM与TE分化阶段,且TE的甲基化重建程度大于ICM。④在Intragenic、intergenic及Promotor区域CpG岛甲基化的动态变化情况：全基因组CpG岛甲基化动态变化主要由Promotor区域CpG岛甲基化变化引起,精子甲基化信号来自Promotor区域的比例为73.7%,卵母细胞为60.8%,2PN期合子为57.9%,4cell期胚胎为52.2%,8cell期胚胎为50.3%,桑椹期胚胎为68.8%,囊胚期ICM为66.6%,滋养层细胞为66.8%,CPG岛在intergenic与Intragenic区域甲基化变化无Promotor区域明显。(3)人种植前胚胎全基因组promoter甲基化水平的动态变化情况。①精子全基因组的promoter甲基化程度最高(Sperm,n=10634),受精后从原核期开始逐步去甲基化(2PN,n=5951),4cell胚胎期(4cell,n=6451)略微升高但低于卵母细胞(Oocyte,n=6578)基因组promoter区甲基化水平,之后又逐步去甲基化,桑椹期胚胎(Morula,n=5581)降至最低,囊胚期的ICM略升高(ICM,n=5723),而TE细胞甲基化程度最高(TE,n=7323),处于卵母细胞与精子之间。②人种植前胚胎全基因组的promoter甲基化的动态变化主要由高甲基化(Peak Mvalue≥0.7)的promoter和低甲基化(Peak Mvalue≤0.4)的promoter区域的变化引起。③HCP、LCP对人种植前胚胎全基因组promoter甲基化的动态变化的影响大于ICP:4cell期其全基因组HCP的比例最低占(40.2%),之后逐渐升高,囊胚期的ICM(58.1%)与TE(59.5%)的HCP比例处于卵母细胞(75.2%)与精子细胞(53%)之间；而promoter区LCP比例则与之相反,4cel1期胚胎的LCP比例最高(38.8%)；ICP的变化不明显。研究结论(1)人种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化呈独特的动态变化模式：受精后由原核开始逐步去甲基化,4cell期全基因组CpG岛的甲基化程度最低,之后逐步重新建立甲基化模式：囊胚期ICM甲基化水平接近卵母细胞,而TE的甲基化水平处于卵母细胞与精子之间；而人及哺乳动物种植前胚胎在全基因组的总体甲基化水平最低点在ICM阶段。(2)基因组在不同发育阶段种植前胚胎CpG岛的甲基化存在三个剧烈变化期,CpG岛甲基化擦除的主要阶段是4cell期,而全基因组总体的擦除则在2cell期。(3)基因组CpG岛甲基化动态变化主要由Promoter区域CpG岛甲基化动态变化引起。(4)人种植前胚胎基因组promoter甲基化同样呈现独特动态变化：受精后由原核开始逐步去甲基化,4cell期略微升高但低于卵母细胞水平,之后又逐步开始去甲基化直至桑椹胚期降至最低,而全基因组CpG岛最低点在4cell期,全基因组总的甲基化水平最低点在ICM阶段；HCP、LCP对全基因组promoter甲基化的动态变化的影响大于ICP。第二部分IVM及1VO桑椹胚CpG岛及启动子甲基化模式比较研究目的IVF-ET患者小卵泡中得到的不成熟卵,大部分可在体外培养24-48h后达成熟,成熟卵受精后行胚胎移植可成功获得临床妊娠,但各研究中心妊娠率的波动较大(0-25%),有些研究认为这部分未成熟卵获得的胚胎质量差、发育潜能低下,移植后几乎无妊娠者,而质疑其利用价值；由此看来促排卵患者获得的未成熟卵是否有利用价值存在争议。此外,窦卵泡期取出未成熟卵,在体外进行24-48h的培养达成熟后可受精,但研究认为这个时间不足以让卵母细胞在成熟前完成甲基化的重建,而使其在后期的胚胎发育过程中出现各种异常。因此,本研究通过对IVM来源处于细胞融合期,即合子基因组启动活化的关键时期一桑椹胚及体内成熟(In vivo maturation IVO)来源的桑椹胚全基因组CpG岛及启动子甲基化情况进行配比分析,从表观遗传学的角度来评价IVM胚胎发育潜能低下的可能机制及安全性。研究方法(1)实验对象实验组：收集2012年1月至2013年12月,ICSI患者和短时受精患者的MI期卵子168枚,IVM成熟的卵受精后一部分进行桑椹胚培养,提取桑椹胚DNA进行甲基化芯片实验；一部分行囊胚培养,行发育潜能观察实验。对照组：形态学观察的对照组来自2012年1月-2013年12月期间以男性因素行ICSI治疗患者,且男方精液参数主要为少弱精且无女方因素； 共100枚MⅡ卵母细胞。甲基化芯片(MeDIP-Chip)对照组来自第一部分实验组第⑥组的桑椹胚。(2)胚胎培养： MⅠ期卵子放置低氧分压的三气培养箱,成熟卵母细胞行ICSI受精,进行桑椹胚及囊胚培养,对照组患者的MⅡ卵母细胞受精后行全胚胎囊胚培养。(3)来自IVM与IVO的桑椹胚先使用酸性Tyrode’s solution去除透明带及粘附的颗粒细胞,移入PCR管裂解细胞提取DNA进行甲基化芯片(MeDIP-Chip)实验,实验方法与第一部分实验一致。(4)芯片甲基化数据的统计Peak Score:探针上峰值的-log10 (P-value)值,反应甲基化程度(Cut off=2);PeakMvalue:探针测得峰值中位数值的Iog2(IP/Input)-比值;n指Peak Score>2的峰值数,或者PeakMvalue对应的峰值数；采用差异甲基化信号分析法(Differenttial enrichment peaks,DEP):计算“M”值研究结果1.IVM卵母细胞共168枚,体外成熟率为83.3%(140/168),40枚成熟卵受精后进行桑椹胚培养,共获得6枚碎片<20%桑椹胚进行DNA提取后进入甲基化芯片实验；其余100枚成熟卵受精后进行囊胚培养参与发育潜能评估实验,两组的2PN率、卵裂率及桑椹胚形成率无统计学差别(P>0.05),但优质囊胚形成率IVM组(11.4%)显著性低于IVO组(46.7%)(P<0.01)。2.CpG岛方面(1)IVM桑椹胚全基因组CpG岛高甲基化的比例高于IVO桑椹胚,相反低甲基化区域的比例却低于IVO桑椹胚。(2)来自IVM桑椹胚甲基化的信号总数(n=3281)多于IVO桑椹胚甲基化的信号总数(n=611)；(3)IVM桑椹胚的Intragenic、intergenic及Promotor各区域的peakMvalue平均值均高于IVO桑椹胚。3.Promotor方面：(1)IVM桑椹胚全基因组Promotor高甲基化的比例高于IVO桑椹胚,但中、低甲基化区域的比例低于对照组。(2)来自IVM桑椹胚甲基化的信号总数(n=3447)多于IVO桑椹胚甲基化的信号总数(n=2744)。研究结论1两组的2PN率、卵裂率及桑椹胚形成率无统计学差别,但优质囊胚形成率IVM组显著性低于IVO组,证实源自促排后的未成熟卵胚胎发育潜能低下。2来自体外成熟卵的桑椹胚与来自体内成熟卵的桑椹胚,在全基因组CpG岛及Promotor区甲基化表水平上均出现较大的差异： IVM桑椹胚CpG岛甲基化的水平高于IVO桑椹胚,IVM桑椹胚Promotor区甲基化的程度高于IVO桑椹胚,表观遗传学上的差异可能是导致促排后的未成熟卵胚胎发育潜能差、妊娠率低下的主要原因,因此这部分卵母细胞在临床上须谨慎运用。全文小结1、受精后由原核开始的逐步去甲基化, CpG岛4cell期最低,启动子区域在桑椹胚期降至最低；2、种植前期胚胎不同发育阶段全基因组的CpG岛及启动子的甲基化存在三个剧烈变化期；3、全基因组CpG岛甲基化动态变化主要由Promotor区域CpG岛甲基化动态变化引起,HCP、LCP对人种植前胚胎全基因组promoter甲基化的动态变化的影响大于ICP；5、促排后的未成熟卵经体外成熟培养后获得的胚胎发育潜能低下；6、源自体外成熟卵与体内成熟卵的桑椹胚,在全基因组CpG岛及Promotor区甲基化水平上均出现较大的差异：该差异可能是导致IVM胚胎发育潜能差、妊娠率低下的主要原因。