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研究目的胃癌是我国现阶段最常见的消化道恶性肿瘤,存在早期诊断率较低,易发生局部和远处转移,患者生存期短、预后差及生存质量不佳。胃癌发生常与肿瘤相关基因结构改变与表达异常有关,研究与肿瘤发生相关的关键基因,对于研制针对胃癌的靶向药物意义重大。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H pylori)感染与胃癌的发生密切相关,为类致癌原,系统规范根除幽门螺杆菌可明显降低胃癌的发病率。幽门螺杆菌导致胃癌发生的具体机制,尤其是幽门螺杆菌与癌基因及抑癌基因的关系,一直是近年来的研究热点,明确其致癌机制可为胃癌的预防和治疗提供重要依据。DBC2(deletion in breast cancer 2)是最初在乳腺癌研究中发现的一种抑癌基因,其表达缺失被证实与乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多种肿瘤的发生密切相关。DBC2能够参与信号转导,在信号转导通路中及蛋白降解中起着关键作用。DBC2还能够调节细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。因此,在肿瘤细胞生长及侵袭转移过程中DBC2可能发挥着重要作用。胃癌的发生与细胞凋亡-增殖平衡的失调有关,表现为增殖过度,而凋亡减少。凋亡是机体清除病理状态下增生的肿瘤细胞的重要途径之一,凋亡调控基因的异常表达会促进肿瘤的发生。癌基因、抑癌基因通过不同形式发挥各自的功能效应,但最终都会影响细胞周期,结果是正常细胞表现为失控性生长,导致恶性肿瘤的发生。胃癌的浸润转移不仅与癌细胞自身的生物学特性有关,而且也是肿瘤细胞和组织微环境相互作用的结果,其过程涉及粘附、趋化等多种作用机制。趋化因子受体CXCR4是一种组织表达广泛的细胞因子受体,与胃癌等多种恶性肿瘤的生长和侵袭转移有关。凭借趋化因子受体与其配体的特异性结合力,肿瘤细胞最终实现了向原发灶之外的远处转移。探寻与胃癌侵袭转移的相关的功能基因,进而获得预示肿瘤复发转移的分子标志物和对转移性胃癌靶向治疗的措施是最终研究目标。因此,研究抑癌基因对胃癌侵袭转移的影响很有必要。尽管DBC2作为抑癌基因与肿瘤相关性的研究很多,但DBC2在幽门螺杆菌相关胃癌发生发展及侵袭转移中的作用尚不十分明确,DBC2能否发挥抑制胃癌的作用?DBC2的表达与幽门螺杆菌感染、胃癌的发生、侵袭转移及临床病理之间的关系如何?如果DBC2能够抑制胃癌细胞的发生发展,那么DBC2是通过何种机制影响胃癌细胞的生物学特性的?这些都是我们本课题研究的目的。目的：1.本研究以正常胃黏膜细胞株、胃癌细胞株及人体胃癌组织标本为实验材料,从蛋白及核酸水平检测DBC2基因的表达,并比较不同组群之间的差异,分析DBC2的表达缺失与幽门螺杆菌感染相关胃癌发生发展的相关性。2.以有淋巴结转移背景的胃腺癌细胞株SGC7901为研究对象,利用细胞转染技术构建DBC2过表达载体,对DBC2基因在mRNA及蛋白水平表达进行检测。3.研究DBC2的表达对感染幽门螺杆菌的胃癌细胞SGC7901的增殖、凋亡和细胞周期等方面的影响,探讨DBC2在胃癌发生发展中的作用机制。4.研究DBC2对胃癌细胞侵袭、转移能力的影响。研究方法1.利用免疫组织化学和免疫细胞化学法检测不同人体组织标本及细胞标本中DBC2的表达情况。2.采用RT-PCR方法检测DBC2mRNA的表达情况,并分析与幽门螺杆菌感染、临床病理特征的关系。3.利用细胞转染技术,设计DBC2过表达载体。4.转染幽门螺杆菌干预的胃癌SGC7901细胞后,利用RT-PCR法和Western Blot法检测DBC2mRNA和蛋白的表达情况。5.利用MTT法、流式细胞仪检测转染前后感染幽门螺杆菌的SGC7901细胞的增殖、凋亡、细胞周期情况。6.免疫组织化学法和Western Blot法检测SGC7901细胞转染前后caspase-3蛋白的表达情况。7. Transwell小室实验检测SGC7901细胞转染前后的转移、侵袭能力。8. Western Blot法检测SGC7901细胞转染前后CXCR4的表达情况。结果1. 在感染幽门螺杆菌的相对正常或炎症组织中,DBC2表现为较高水平的表达。而在胃癌组织中,DBC2则主要呈低表达或无表达(P<0.05)。在24h和48h检测发现,DBC2在GES-1-Hp细胞爬片中呈较高水平阳性表达,而在SGC7901-Hp组中DBC2则表现为低表达或缺失表达,两者差异明显(P<0.05)。同时还发现,在感染Hp的24h和48小时两个时间点的同组细胞爬片间,DBC2的表达无明显差异。2. DBC2 mRNA在感染Hp的GES-1细胞中在24h和48h均呈高扩增状态,表现为高表达,而在感染Hp的SGC7901细胞中DBC2 mRNA扩增倍数较低,呈极低水平表达,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。3.与浸润深度为T1、T2的胃癌组织相比,浸润深度为T3、T4的胃癌组织具有更明显的DBC2的表达缺失,具有统计学意义(P<0.05)。与Ⅰ、Ⅱ期胃癌组织相比,Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织的DBC2的表达缺失明显(P<0.05)。而且,DBC2的缺失表达与肿瘤分化程度密切相关,肿瘤分化程度越低,DBC2缺失表达更明显。同时发现,DBC2的表达缺失与胃癌患者的性别、发病年龄、及肿瘤Borrmann分型和大小无明显相关性(P>0.05)。4.与GES-1细胞相比较,SGC7901细胞的DBC2mRNA的表达水平是明显降低的,差异具有统计学意义(P<0.05)。与SGC7901空载体组相比,而转染的SGC7901细胞在转染24h后的DBC2mRNA表达水平即明显升高,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。并且转染48h后SGC7901细胞内的DBC2mRNA扩增水平进一步升高,高于GES-1细胞内的扩增倍数,差异有统计学意义(P<0.05)。5. 用DBC2/GAPDH吸光度比值代表DBC2蛋白表达水平,以SGC7901-DBC2转染组最高。GES-1组及SGC7901-DBC2转染组内的目的基因DBC2蛋白呈明显较高水平表达,而SGC7901空载体转染组内DBC2蛋白呈极低水平表达,前两者与后者相比差异具有统计学意义(P<0.05),说明外源性DBC2在胃癌细胞系SGC7901中得到了较稳定表达。6. 与GES-1细胞相比,SGC7901细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。与转染空载体的SGC7901组相比,转染DBC2组的细胞自第二日开始增殖减慢,时间越长,两者表现的差异更为显著(P<0.05)。7. 与未转染的SGC7901细胞相比,DBC2转染组细胞周期中S期的比例升高,同时伴随G2期和G1期比例的下降。说明DBC2对胃癌细胞SGC7901的生长抑制调节是通过诱导细胞周期S期(DNA复制期)阻滞,以阻止细胞进入G2期而实现的。8.24h与GES-1细胞(3.55%±0.73%)及SGC7901空载体细胞组(6.17%±1.85%)相比,转染DBC2的SGC7901细胞组凋亡率(12.37%±1.67%)均明显升高(P<0.05)。48h后与GES-1细胞(3.50%±0.89%)及SGC7901空载体细胞组(6.18%±1.97%)相比,转染DBC2的SGC7901细胞组凋亡率(16.84%±3.62%)均明显升高(P<0.05)9.与阴性对照组(终评分2.18±0.06)和空载体组(终评分2.21±0.11)相比,转染DBC2的SGC7901细胞的SGC7901-DBC2转染组caspase3活化(终评分9.87±1.65)明显,表达率明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。10.与SGC7901细胞阴性对照组(0.46±0.04)相比,SGC7901-DBC2转染组(0.63±0.08)的caspase3蛋白活化表达水平明显升高,具有统计学意义(P<0.01)。11.在24h这一时间点,正常胃黏膜上皮细胞GES-1的迁移能力是极低的,与胃癌SGC7901-空载体组及SGC7901-DBC2转染组穿膜细胞数相比,差异有统计学意义(P<0.05)。同时发现,与SGC7901-空载体组相比,SGC7901-DBC2转染组的穿膜细胞数明显降低(P<0.05)。在48h时,SGC7901-DBC2转染组的穿膜细胞数仍相对明显降低,与SGC7901-空载体组相比差异有统计学意义(P<0.05)。12.在24h,与GES-1细胞相比,胃癌SGC7901-空载体组及SGC7901-DBC2转染组侵袭穿膜细胞数相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与肿瘤细胞的生物学特征相一致。同时,相比SGC7901-空载体组穿膜细胞数,SGC7901-DBC2转染组明显降低(P<0.05)。而在48h时,SGC7901-DBC2转染组穿膜细胞数降低更为明显,相比SGC7901-空载体组而言,差异有统计学意义(P<0.05)。13.与SGC7901细胞空白对照组(0.15±0.01)和SGC7901-空载体组相比(0.16±0.01), SGC7901-DBC2转染组(0.08±0.01)的CXCR4蛋白的表达水平明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论1.正常胃组织及胃黏膜上皮细胞中,DBC2呈高表达状态。DBC2在幽门螺杆菌相关胃癌组织及胃癌细胞中在转录水平和蛋白质水平均呈表达高频缺失,而且DBC2的表达缺失水平与肿瘤临床分期、浸润深度以及分化程度密切相关。2.我们成功完成了针对胃癌SGC7901细胞的DBC2重组过表达载体的构建与转染。应用RT-PCR及Western-blot技术从转录和蛋白水平检测了感染幽门螺杆菌的SGC7901细胞转染前后DBC2的表达差异。与对照组相比,转染后细胞中的DBC2水平明显升高。3.DBC2具有能够抑制幽门螺杆菌相关胃癌细胞增殖活力的能力,影响细胞周期,促进肿瘤细胞的凋亡,从而实现抑癌作用。凋亡的调控可能是通过影响caspase-3表达实现的。DBC2可能通过增强细胞中caspase-3舌化表达而促进细胞凋亡,进而起到抑制肿瘤发生发展的作用。4.DBC2能够抑制幽门螺杆菌相关胃癌细胞的侵袭和转移能力,并且能抑制趋化因子受体CXCR4的表达。DBC2可能通过抑制CXCR4的表达这一途径而抑制肿瘤侵袭转移的。创新性及意义1. 目前有关DBC2作为抑癌基因与幽门螺杆菌相关胃癌关系的研究鲜有报道,本研究首次检测了DBC2在幽门螺杆菌相关胃癌中的表达缺失情况及与临床病理特征之间的关系。2. 首次相对较全面研究了DBC2干预下对于感染幽门螺杆菌的胃癌SGC7901细胞的增殖、凋亡及细胞周期等生物学特性的影响。3.对于将来临床上分子靶向治疗幽门螺杆菌相关胃癌奠定了理论基础。