研究背景与研究目的一、研究背景：我国结直肠癌的发病率位于肺癌和胃癌之后,居第3位,病死率位于肺癌、胃癌、肝癌和食管癌之后,居第5位。近年来,随着人民生活水平的不断提高、生活习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化,我国结直肠癌的发病率和病死率均保持上升趋势,大多数患者发现时已属于中晚期,预后较差,是严重危害人民健康的恶性肿瘤之一。目前,化疗是针对晚期大肠癌的主要治疗手段之一,特别对于合并肝、肺转移者,现行的结直肠癌的化疗方案有De Gramont方案、改良De Gramont方案、AIO方案、FOLFOX4方案. FOLFOX6方案、XELOX方案、FOLFIRI方案、贝伐单抗/FOLFIRI方案和西妥昔单抗/FOLFIRI方案等。伊立替康与5-FU、LV组成的FOLFIRI方案是目前治疗进展期大肠癌的标准化疗方案之一,伊立替康是喜树碱半合成衍生物,通过与肿瘤细胞内拓扑异构酶I(TOPI)活性部位结合,抑制TOPI的活性,使肿瘤细胞DNA单链断裂,促使肿瘤细胞凋亡而实现抗肿瘤的目的。但是,随着伊立替康在临床上的广泛应用,研究发现,其治疗的有效率约为49%,影响其疗效的主要原因是肿瘤细胞对其产生耐药。在伊立替康问世以来,人们不断探索其与其他细胞毒性药物或生物靶向药物等的联合方案,以期进一步提高疗效。姜黄系姜科植物姜黄的干燥根茎,中医上有行气破淤、活血止痛、清心解郁等功效,是临床治疗腹痛、胃炎及跌打肿痛的常用中药。其主要化学成分姜黄素(Curcumin)是一种多酚类化合物,由于它的色泽稳定并且毒性极低,现已经广泛应用于食品添加剂及染料中。姜黄素药理作用主要有抗肿瘤、逆转肿瘤对化疗药物产生的多药耐药、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗艾滋病毒等。目前对于姜黄素的研究热点主要是关于姜黄素与化疗药物的协同作用,研究已证实姜黄素可以通过不同的作用机制增强化疗药物的疗效,逆转肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药。姜黄素是否可以增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞的杀伤作用,姜黄素与伊立替康是否具有协同作用目前尚无研究报道。故本研究拟通过比较姜黄素单药、伊立替康单药以及姜黄素联合伊立替康(混合给药、序贯给药等不同给药方式)对结直肠癌lovo细胞作用效果,明确姜黄素是否可以增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞的杀伤作用,并进一步使用系统生物学(蛋白组学及生物信息学)探索两药对结直肠癌lovo细胞协同作用的可能机制,为两药在临床的联合应用提供实验依据。二、研究目的：本课题拟研究姜黄素联合伊立替康(混合给药、序贯给药等给药方式)对结直肠癌lovo细胞作用效果,并探索姜黄素联合伊立替康对lovo细胞作用的可能机制,为两药在临床上的联合应用提供实验依据。方法：第一部分：姜黄素与伊立替康对结直肠癌lovo细胞的协同作用一、姜黄素对lovo细胞的浓度时间梯度作用曲线将lovo细胞设立8个实验组、1个阴性对照组、1个空白对照组,每组6个复孔,8个实验组分别按姜黄素浓度梯度1.25、2.5、5、10、15、20、30、40gg/ml配制分组,阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞、空白对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO,分别作用时间梯度为24、48、72、96、120h；MTT法检测每组lovo细胞的OD值；比较所有组lovo细胞OD值的差异,及各实验组lovo细胞OD值与阴性对照组的差异,明确各浓度姜黄素对lovo细胞的作用；按以下公式计算各实验组抑制率(%)：抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)／(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100%,再以作用时间为横坐标,细胞抑制率为纵坐标,绘出各个浓度的细胞时间生长抑制曲线；在所选浓度梯度中筛选出姜黄素对lovo细胞无抑制作用的最大浓度(M0)和计算出姜黄素对lovo细胞48h半抑制浓度(IC5048h)。二、伊立替康对lovo细胞的浓度时间梯度作用曲线将lovo细胞设立7个实验组、1个阴性对照组、1个空白对照组,每组6个复孔,7个实验组分别按伊立替康浓度梯度1.925、3.85、7.7、15.4、30.8、61.6、132.2μg/ml配制分组,阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞、空白对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO,分别作用时间梯度为24、48、72、96、120h；MTT法检测每组lovo细胞的OD值；比较所有组lovo细胞OD值的差异,及各实验组lovo细胞OD值与阴性对照组的差异,明确各浓度伊立替康对lovo细胞的作用；按以下公式计算各实验组抑制率(%)：抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100%,再以作用时间为横坐标,细胞抑制率为纵坐标,绘出各个浓度的细胞时间生长抑制曲线；计算出伊立替康对结直肠癌lovo细胞24h半抑制浓度([C5024h)及48h半抑制浓度(IC5048h)。(三)、不同浓度姜黄素与伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果1、Mo浓度姜黄素与IC5024h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果设立5个实验分组：阴性对照组、伊立替康单药组、姜黄素单药组、混合给药组、序贯给药组,每组3个复孔；阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞；姜黄素单药组为用M0浓度姜黄素作用lovo细胞24h；伊立替康单药组为用IC5024h浓度伊立替康作用lovo细胞24h；混合给药组为用姜黄素与伊立替康1：1比例混合溶液作用lovo细胞24h,姜黄素终浓度为M0浓度,伊立替康终浓度为IC5024h浓度；序贯给药组为先用Mo浓度姜黄素作用lovo细胞24h,洗净后,再用IC5024h伊立替康作用lovo细胞24h；流式细胞术检测各组lovo细胞的凋亡率；比较所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异,再进一步比较混合给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与混合给药组lovo细胞总凋亡率的组间差异。2、Mo浓度姜黄素与IC5048h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果设立5个实验分组：阴性对照组、伊立替康单药组、姜黄素单药组、混合给药组、序贯给药组,每组3个复孔；阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞；姜黄素单药组为用M0浓度姜黄素作用lovo细胞48h；伊立替康单药组为用IC5048h浓度伊立替康作用lovo细胞48h；混合给药组为用姜黄素与伊立替康1：1比例混合溶液作用lovo细胞48h,姜黄素终浓度为M0浓度,伊立替康终浓度为IC5048h浓度；序贯给药组为先用Mo浓度姜黄素作用lovo细胞48h,洗净后,再用IC5048h伊立替康作用lovo细胞48h；流式细胞术检测各组lovo细胞的凋亡率;比较所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异,再进一步比较混合给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与混合给药组lovo细胞总凋亡率的组间差异。3、IC5048h浓度姜黄素与IC5048h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果设立5个实验分组：阴性对照组、伊立替康单药组、姜黄素单药组、混合给药组、序贯给药组,每组3个复孔；阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞；姜黄素单药组为用IC5048h浓度姜黄素作用lovo细胞48h；伊立替康单药组为用IC5048h浓度伊立替康作用lovo细胞48h；混合给药组为用姜黄素与伊立替康1：1比例混合溶液作用lovo细胞48h,姜黄素终浓度为IC5048h浓度,伊立替康终浓度为IC5048h浓度；序贯给药组为先用IC5048h浓度姜黄素作用lovo细胞48h,洗净后,再用IC5048h伊立替康作用lovo细胞48h；流式细胞术检测各组lovo细胞的凋亡率；比较所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异,再进一步比较混合给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与伊立替康单药组、序贯给药组与混合给药组lovo细胞总凋亡率的组间差异。第二部分姜黄素协同伊立替康对lovo细胞作用的蛋白组学分析设立5个实验分组：阴性对照组、伊立替康单药组、姜黄素单药组、混合给药组、序贯给药组,每组3个复孔；阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO+lovo细胞；姜黄素单药组为用IC5048h浓度姜黄素作用lovo细胞48h；伊立替康单药组为用IC5048h浓度伊立替康作用lovo细胞48h；混合给药组为用姜黄素与伊立替康1：1比例混合溶液作用lovo细胞48h,姜黄素终浓度为IC5048h浓度,伊立替康终浓度为IC5048h浓度；序贯给药组为先用IC5048h浓度姜黄素作用lovo细胞48h,洗净后,再用IC5048h伊立替康作用lovo细胞48h；提取出各组lovo细胞的总蛋白,将蛋白样品进行双向凝胶电泳分离,获取上述各组凝胶图谱,Cydye染料染色、扫描、软件识别、合成、匹配、分析组间的差异,按照差异表达倍数为1.5倍的筛选原则,经过不同组间的比较,筛选出组间差异表达蛋白点,切取凝胶中差异表达蛋白质,胰酶消化、脱盐、经MALDI-TOF-MS质谱技术分析获取肽质量指纹图谱(PMF),采用Mascot软件在Swissprot数据库检索,最终鉴定出组间差异表达蛋白质。对组间差异表达蛋白功能进行分类,分析组间差异表达蛋白参与姜黄素与伊立替康联合应用对结直肠癌lovo细胞作用的可能机制。第三部分：姜黄素协同伊立替康对lovo细胞作用可能机制的生物信息学分析借助目前国际上研究蛋白质相互作用的权威数据库STRING (http://string. embl.de/),利用软件STRING9.1,构建组间差异表达蛋白的相互作用网络图；根据蛋白功能、蛋白相互作用关系以及组间蛋白表达变化曲线,挑选出关键蛋白点；按照STRING9.1软件蛋白相互作用关系的评分标准评定关键蛋白点相互作用关系的密切程度；分析姜黄素增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞杀伤作用以及不同给药方式效能差异的关键蛋白所在信号通路的可能作用机制。结果：第一部分：姜黄素与伊立替康对结直肠癌lovo细胞的协同作用一、姜黄素对Iovo细胞的浓度时间梯度作用曲线浓度为1.25μg/ml的姜黄素组,不同时间梯度作用后,lovo细胞OD值与阴性对照组比较,有显著性差异(P<0.05),该组lovo细胞抑制率在大部分时间梯度(72h除外)均为负值,表明浓度为1.25μg/ml的姜黄素对lovo细胞生长有促进作用；浓度为2.5、5μg/ml的姜黄素组,不同时间梯度作用后,该两组lovo细胞OD值分别与阴性对照组比较,均无显著性差异(P>0.05),表明浓度为2.5、5μg/ml的姜黄素对lovo细胞生长无作用；浓度为10、15、20、30、40μg/ml的姜黄素组,不同时间梯度作用后,该五组lovo细胞OD值分别与阴性对照组比较,均有显著性差异(P<0.05),该五组lovo细胞抑制率在所有时间梯度均为正值,表明浓度为10、15、20、30、40μg/ml的姜黄素对lovo细胞生长具有明显抑制作用；另外,浓度为10μg/ml的姜黄素,随着作用时间的延长,对lovo细胞的抑制作用逐渐增强,而浓度为15、20、30、40μ,g/ml的姜黄素对lovo细胞具有很强的抑制作用,与作用时间无关；经筛选,5μg/ml是所选浓度梯度中姜黄素对lovo细胞无抑制作用的最大浓度(M0浓度),经计算得出：姜黄素对lovo细胞48h半抑制浓度(IC5048h)为5.104μg/ml。二、伊立替康对lovo细胞的浓度时间梯度作用曲线浓度为1.925、3.85、7.7、15.4、30.8、61.6、132.2μg/ml的伊立替康组,不同时间梯度作用后,所有组lovo细胞OD值分别与阴性对照组比较,均有显著性差异(P<0.05),而且所有组lovo细胞抑制率在所有时间梯度均为正值,表明浓度为1.925、3.85、7.7、15.4、30.8、61.6、132.2μg/ml的伊立替康对lovo细胞生长具有明显抑制作用；另外,当伊立替康浓度为1.925、3.85μg/ml时,伊立替康对lovo细胞的抑制作用处于较低水平,与作用时间无关；当伊立替康浓度为7.7、15.4、30.8、61.6、132.2μg/ml时,伊立替康对lovo细胞的抑制作用随着浓度升高和作用时间延长而逐渐增强,呈剂量、时间依赖性；经计算得出：伊立替康对lovo细胞24h半抑制浓度IC5024h为56.201μg/ml、48h半抑制浓度IC5048h为21.183μg/ml。三、不同浓度姜黄素与伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果1、Mo浓度姜黄素与IC5024h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果姜黄素浓度为5μg/ml,伊立替康浓度为56.201μg/ml,作用24h,所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异比较有显著性差异(F=151.913,P=0.000)；混合给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康混合给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于混合给药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于姜黄素+伊立替康混合给药组。2、Mo浓度姜黄素与IC5048h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果姜黄素浓度为5μg/ml,伊立替康浓度为21.183μg/ml,作用48h,所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异比较有显著性差异(F=107.464,P=0.000)；混合给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康混合给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于混合给药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于姜黄素+伊立替康混合给药组。3、IC5048h浓度姜黄素与IC5048h浓度伊立替康对结直肠癌lovo细胞的联合作用效果姜黄素浓度为5.104μg/ml,伊立替康浓度为21.183μg/ml,作用48h,所有组lovo细胞总凋亡率的组间差异比较有显著性差异(F=847.702,P=0.000)；混合给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康混合给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于伊立替康单药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于伊立替康单药；序贯给药组lovo细胞的总凋亡率显著高于混合给药组(P<0.05),表明姜黄素+伊立替康序贯给药诱导lovo细胞凋亡的效能显著高于姜黄素+伊立替康混合给药组。第二部分姜黄素协同伊立替康对lovo细胞作用的蛋白组学分析通过2-D电泳分离出各组lovo细胞的蛋白质组,再通过DeCyder V6.5分析软件,按照差异表达倍数为1.5倍的筛选原则,经过不同组间的比较,筛选出54个显著差异表达的蛋白点；经质谱仪鉴定：这54个显著差异表达的蛋白点中,有13个是相同的蛋白点,剔除这13个相同蛋白点,质谱鉴定确认显著差异表达的蛋白点为41个。经分析发现这41个蛋白功能主要涉及细胞内钙离子通路、细胞呼吸链通路及细胞内氧化还原反应通路等信号通路。其中,与细胞内钙离子通路相关的蛋白点有：Calnexi、Nucleobindin-1、Annexin A1、Annexin A5、Calpain small subunit1、Translocon-associated protein subunit delta;与细胞内呼吸链通路相关的蛋白点有：NADH-ubiquinone oxidoreductase30kDa subunit、NADH-ubiquinone oxidoreductase23kDa subunit、Ubiquinone biosynthesis methyltransferase COQ5、Flavoprotein subunit of complex Ⅱ;与细胞内氧化还原反应通路相关的蛋白点有：Peroxiredoxin-4、Peroxiredoxin-2、 Glutathione S-transferase Mu5、Protein disulfide-isomerase。第三部分：姜黄素协同伊立替康对lovo细胞作用可能机制的生物信息学分析使用STRING9.05软件,构建了41个显著差异表达蛋白的相互作用网络图,从图中发现：NDUFS8、NDUFS7、NDUFS3、NDUFS1、NDUFS2、NDUFA2、 NDUFV1、COQ5、SDHB、SDHA、SDHC蛋白点之间交汇形成密切的相互作用网,它们主要功能是调控细胞内呼吸链的电子输送；HNRNPM、HNRNPH3、HNRNPH1蛋白点之间存在着相互作用,它们主要功能是在体内与前体mRNA偶联蛋白结合,参与细胞内前体mRNA的剪接；SSR4、P4H、CAPNS1、CANX、 PRDX4、RUVBL1、CCT6A、RUVBL2、ACTG1、ANXA5、ANXA1、KRT8、 PSMD10、PSMD11、PSMC5之间形成线性的作用关系,它们主要功能是调节细胞内外钙离子的交换,细胞内氧化还原反应及维护细胞内内质网的正常功能；CAPZA1与CAPG主要是调节细胞内肌动蛋白的功能,与细胞的运动有密切的关系。余蛋白点都是孤立的蛋白点。根据蛋白功能、蛋白相互作用关系以及组间蛋白表达变化曲线,我们在41个蛋白点中挑选出3个关键蛋白点,它们分别为：谷胱甘肽S-转移酶Mu5(Glutathione S-transferase Mu5, GSTM5)、过氧化物酶4(Peroxiredoxin-4, PRDX4)、二硫异构酶(Protein disulfide-isomerase, P4HB、 PDI)。进一步对GSTM5、PRDX4和P4HB的相互作用关系进行分析,结果发现：GSTM5与PRDX4以及GSTM5与P4HB的相互作用关系的评分均为0,而PRDX4与P4HB相互作用关系的评分为0.682；结果提示：GSTM5作为一个独立因素发挥作用,而PRDX4和P4HB在发挥作用过程中密切相互作用。生物信息学检测发现：GSTM5在化学药物的耐药中发挥着作用,即GSTM5通过与化疗药物耦合,形成GSH-化疗药物的复合物,增加了化疗药物的水溶性,促使化疗药物从细胞内排出,从而降低化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用；而PRDX、P4HB在内质网应激及未折叠蛋白反应中相互作用并且发挥着非常重要的作用。GSTM5、PRDX4和P4HB组间表达变化发现：姜黄素具有抑制GSTM5表达的作用,与伊立替康联合应用,姜黄素能有效地抑制伊立替康作用后所致的GSTM5表达上调,并且序贯给药法比混合给药法更能发挥姜黄素抑制GSTM5表达的作用；姜黄素具有上调PRDX4和P4HB表达的作用,并且序贯给药组与伊立替康单药组比较,PRDX4和P4HB表达均有显著性差异。结论：第一部分：1、姜黄素对结直肠癌lovo细胞的作用具有正负两面性,其正负作用呈剂量依赖性,姜黄素在一定浓度内具有抗结直肠癌lovo细胞作用,而且5μg/ml是所选浓度梯度中姜黄素对lovo细胞无抑制作用的最大浓度(M0浓度)；2、伊立替康具有抑制lovo细胞增殖的作用,其抑制作用随着浓度升高和作用时间延长而逐渐增强,呈剂量、时间依赖性；3、姜黄素可以增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞的杀伤作用；贯序给药法比混合给药法更有效地提高姜黄素增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞杀伤作用的效能；第二部分：1、蛋白组学显示：姜黄素增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞杀伤作用以及不同给药方式效能差异的作用机制与Cytokeratin-9等41个蛋白有关；按蛋白功能分类：41个蛋白功能主要涉及细胞内钙离子通路、细胞呼吸链通路及细胞内氧化还原反应通路等信号通路；2、蛋白组学分析提示：姜黄素增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞杀伤作用以及不同给药方式效能差异的粗略作用机制可能是通过相关蛋白作用于细胞膜钙通道,调节细胞内钙离子浓度,以及通过相关蛋白作用于细胞内呼吸链通路、氧化还原反应通路,改变细胞内的ROS水平,从而达到抗肿瘤作用。但上述作用机制目前尚不明确,有待进一步深入研究,但也为我们提供了研究方向。第三部分：1、生物信息学分析提示：姜黄素增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞的杀伤作用以及不同给药方式效能差异的机制之一可能是姜黄素抑制了GSTM5的表达和活性,从而抑制了GSTM5作为药物泵的作用,提高了细胞内伊立替康的浓度,增强了对lovo细胞的杀伤作用；另一机制可能是姜黄素通过改变lovo细胞内PDI及PRDX4的功能,干扰细胞内内质网蛋白质二硫键的合成,使蛋白质不能正确折叠或者错误折叠,介导细胞内产生内质网应激,诱导lovo细胞凋亡,从而增强伊立替康对结直肠癌lovo细胞的杀伤作用。2、以上作用机制尚有待进一步通过实验进行验证；上述研究结果为我们使用姜黄素逆转结直肠癌细胞对伊立替康的临床耐药,提高伊立替康化疗的效率指出了研究方向；下一步研究我们将进一步验证上述作用机制,并再深入研究具体作用机制以及进行动物体内实验。