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实验目的衰老相关研究是近年来生命科学的一个热点,老年性疾病的高发率及社会人口老龄化进程的不断加快,使得衰老相关机理的研究和延缓衰老的研究不再单单是一个医学问题,更成为一个社会问题。机体最基本的构成单位和功能单位是细胞,而干细胞更是维持成熟且具有功能的组织和器官的稳态的关键。因为干细胞具有高度的自我更新和增殖分化能力，所以在传统观念上它被认为是不朽的不会衰老的。然而当受到机体内部因素或者外部损伤因素的作用下，组织修复能力的降低和癌症的易感率的增高，表明干细胞可能发生着各种内外因素造成其损伤相关的功能下降甚至衰老。造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）负责终身生产所有类型的血细胞，因此它位于机体造血系统地顶层，它的衰老不仅关系着造血系统和免疫系统的稳态，更有实验证明HSC衰老与机体的衰老有密切的联系。最近的研究报道，DNA损伤是导致成体干细胞数量减少和功能衰退的主要机制之一。事实上生物基因组的完整性受到内源性和外源性多种损伤因素的影响，其中辐射致细胞DNA损伤的积累，是导致细胞衰老和疾病发生的一个重要因素。几千年传承下来的祖国中医医学博大精深，如何将祖国传统医学与现代西医合理有效的结合起来具有重要的意义同时也是本课题的创新所在。人参是祖国医学的名贵药材，它具有活血、补气治疗劳伤虚损的作用。现代医学研究证明人参中提取的人参皂苷单体Rg1(ginsenoside Rgl)是其主要药物活性成分之一。已有研究报道，人参及其提取物对细胞有辐射保护作用。迄今，尚不清楚人参皂苷调控辐射所致造血干细胞衰老的机制。本实验通过χ射线全身照射（TBI）诱导小鼠造血干/祖细胞DNA损伤，进而探讨电离辐射损伤导致的造血干细胞衰老过程中人参皂苷单体Rg1的抗衰老作用及其相关的调控机制。能够为我们下一步寻找合适的途径和时间点来对造血干细胞衰老进行有效的干预提供重要的理论及实践依据。实验方法：1.电离辐射诱导造血干细胞衰老模型构建：模型组，C57BL/6小鼠全身一次性χ线照射，剂量为6.5GY；对照组：作假照射，采取于辐射组相同处理，但不进行照射。2.模型小鼠衰老相关指标检测：照射后第3、7、14、28天，分别观察各组小鼠的行为表现；采集外周血，检测外周血象；脱颈处死小鼠后，取出脾脏测定脾指数，取两侧股骨及胫骨,冲出骨髓后计数骨髓单个核细胞及造血干细胞。3.造血干/祖细胞的分离、纯化与鉴定：将提取出的骨髓单个核细胞通过MACS分选得到标记细胞;流式检测标记细胞中Sca-1+HSC/HPC的百分比。台酚蓝染色检测细胞存活率。4. Sca-1+HSC/HPC衰老相关生物学检测：SA-β-gal染色检测细胞的衰老。增殖与分化能力通过混合性集落的（CFU-Mix）培养测定;流式细胞术测定其处于G1期阻滞的细胞比例。5.单细胞凝胶电泳（彗星试验）检测造血干细胞DNA损伤情况。6.Sca-1+HSC/HPC中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的检测。7.衰老相关基因及其蛋白表达检测：PCR检测与衰老相关的基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA的表达，Western blot检测其蛋白的表达以研究Rg1延缓或治疗Sca-1+HSC/HPC衰老与p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cip1/Waf1信号通路之间的关系实验结果：1.照射后的各时间点，模型组小鼠均表现为精神不振、行为迟缓，进食减少和毛色失润等。外周血象下降明显。亚致死剂量照射后照射组小鼠单个股骨的骨髓单个核细胞数目及其分选后的Sca-1+HSC/HPC数目较假照射组均急剧下降。脾指数明显降低。2.免疫磁珠分离纯化后，流式细胞术结果显示Sca-1+细胞纯度为93.660.83%。分选的Sca-1+细胞活性为96%～99%。3.照射组Sca-1+HSC/HPC数量于照射后1d急剧下降，照射后3d耗竭至最低，照射后7d开始缓慢恢复。照射Rg1组Sca-1+HSC/HPC数量于照射后1天大幅下降，照射后3d回升，照射后7d回升加快。4.照射组分选后的Sca-1+HSC/HPC其SA-β-gal染色阳性率较假照射组显著增加；照射Rg1组阳性率低于照射组。照射组混合性造血祖细胞集落形成数减少，集落细胞数少，照射Rg1组形成CFU-Mix的数量明显较照射组明显增加。流式细胞检测显示照射组细胞G0/G1期比例明显增高；在照射后第3天和第7天照射Rg1组G1期细胞比例较照射组降低。5.荧光显微镜下观察显示，假照射组细胞核基本完整，呈圆形，细胞核染色体DNA未出现明显迁移。而照射组中多数细胞DNA有明显的彗星状尾部，照射Rg1组的细胞也可见彗尾，但长度和面积均小于照射组。照射组的尾长和Olive尾矩均明显大于假照射组和照射Rg1组。6.与假照射组相比，照射组Sca-1+HSC/HPC的SOD活性明显降低，MDA含量明显升高；与照射组相比，照射Rg1组Sca-1+HSC/HPC SOD活性明显升高，MDA含量明显降低。7.全身一次性照射后1d，照射组造血干祖细胞的衰老相关基因（p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1）mRNA表达水平显著高于假照射组；照射Rg1组基因的mRNA的表达水平低于照射组8.Western blot结果显示照射组造血干祖细胞的衰老相关基因p16INK4a，p19Arf，p53，p21Cip1/Waf1蛋白表达水平较假照射组明显升高；照射Rg1组蛋白表达水平低于照射组。结论1. χ射线照射可以诱导造血干/祖细胞的衰老。2.通过MACS分选可以得到纯化高活性良好的Sca-1+细胞。3.Rg1具有延缓及治疗辐射损伤诱导的Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。4.p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1所介导的信号通路在辐射诱导的Sca-1+HSC/HPC衰老中可能发挥重要作用。Rg1可以有效地抑制这些衰老相关基因的表达。