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猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要症状的急性、高度接触性肠道传染病。自2010年秋以来,PEDV在全国大范围的流行,给我国养猪业带来了巨大的经济损失,对于PEDV的预防,目前主要还是以疫苗免疫为主,然而由于各个养殖场疫苗接种方法的不同、疫苗质量的差异等原因,虽然接种了 PED疫苗,但接种后抗体水平往往参差不齐,因此对于PED疫苗免疫后抗体水平的检测尤为重要。本试验分别以纯化后的PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立了能够检测母猪初乳中PEDV IgA抗体和猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,本研究的内容包括以下部分:1)PEDV纯化全病毒抗原和重组N蛋白抗原的制备首先,将实验室制备保存的pET-28B-N重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析初步确定重组蛋白得到了可溶性表达,诱导条件为15℃下加入0.5 mmol/L的IPTG诱导24h,蛋白表达量最高,经BCA法测得重组N蛋白的浓度为1.23 mg/mL,表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PEDV标准阳性血清发生特异性反应。其次,收集PEDV细胞培养液,加入10%体积的Triton X-100进行处理后,采用超速离心法对其进行纯化,获得PEDV全病毒抗原,经BCA法测得浓度为3.95 mg/mL。2)检测母猪初乳中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测母猪初乳中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原和重组N蛋白均为2 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉37℃封闭2h,乳汁样品最佳稀释倍分别为1:30和1:10,37℃反应60min;羊抗猪IgA-HRP工作浓度为1:10000,37℃反应60min:TMB 37℃反应15min。两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,与BIONNTE公司商品化试剂盒比较,符合率分别为92.31%和88.46%,证明两种方法均具有较好的特异性、重复性及较高符合率,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。3)检测血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原为1μg/mL,重组N蛋白为4.92μg/mL,血清样品最佳稀释倍数分别为1:100和1:50,37℃反应60min;羊抗猪IgG-HRP工作浓度为1:5000,反应时间分别为37℃反应60min和37℃反应30min;TMB 37℃反应15min;两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,最低检测限分别为1:1600和1:800,证明两种方法均可以为PEDV诊断和流行病学调查提供依据。综上所述,本研究利用PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,成功建立了间接ELISA抗体检测方法,为PEDV血清学诊断、免疫抗体检测及免疫学调查提供了简便、快速的检测手段。也为后续试剂盒的研发打下基础。