紫红曲霉PKS基因的克隆分析及MpLigD4基因缺失株的构建

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本研究主要分为两部分,紫红曲霉(Monascus purpureus)中PKS基因的克隆与分析;及紫红曲霉MpLigD4基因缺失株的构建。第一部分,本研究使用引物LC1/LC2c得到紫红曲霉中的NR-PKS的基因片段;使用引物LC3/LC5c和KAF2/KAR1得到紫红曲霉中的PR-PKS的基因片段。本研究还创建出一套扩增PKS编码基因的方法,利用此方法,根据ER的氨基酸保守序列设计简并引物,成功获得紫红曲霉中一条ER编码基因的全长核苷酸序列。在此基础上,对该ER基因进行了序列分析,发现该基因在进化上的特异性。这为进一步研究PKS提供了有效的方法,对聚酮类化合物合成的研究具有重要意义。第二部分,使用简并引物得到目的基因片段,通过基因走读的方法得到全长及一定的上下游序列。本研究采用常规双交换的方式缺失MpLigD4基因关键区域(600 bp-1500bp),缺失掉该基因的从上游300 bp到该基因序列上的1700 bp长约2000 bp的序列片段。但是由于其同源重组效率太低,且假阳性太多,所以改进双交换的方法,在打靶质粒同源区的一侧插入oliC31基因。该基因对三乙基锡高度敏感,三乙基锡的使用浓度为10nM,通过改进后的双交换法构建了MpLigD4基因缺失的紫红曲霉菌株。本研究为进一步研究MpLigD4基因功能提供了基础,为今后的基因功能研究提供了基因操作平台。
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