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链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪病病原体,能引起猪疫病,临床上能引起猪的高热、脑膜炎、败血症、关节炎、神经症状等。该菌有33个血清型,其中猪链球菌2型(SS2)流行最广、且致病性最强,并能感染人,是一种重要的人畜共患病病原。目前对SS2研究较多,但其在宿主体内如何生存、繁殖并成功侵染宿主的机制还不清楚。猪链球菌IgG结合蛋白(SSPG)是一种可与多种动物IgG结合的细胞壁蛋白,广泛地存在于猪链球菌的各个血清型当中,被认为是共同抗原。然而其在猪链球菌中的生物学意义并不清楚。本实验的目的在于采取多种手段探求SSPG与SS2在致病力上的相关性,具体内容如下:1.SSPG的克隆表达纯化及其免疫学特性的初步研究SSPG与宿主免疫系统的相互作用可能是猪链球菌在感染中逃避免疫监视,造成宿主全身性感染的重要原因,也可能是与猪链球菌致病力大小密切相关的因子。利用纯化的SSPG并探求其免疫学特性,有利于发现SSPG与猪链球菌致病力的关系。实验用PCR的方法从猪链球菌1/2、1、2和9型菌株基因组中扩增SSPG基因,构建pET-28a-SPG重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL-21菌株。IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定为可高效表达。镍亲和层析及分子筛两步纯化后获得纯度较高的目的蛋白。Western blotting及ELISA试验结果表明,所有纯化的目的蛋白均可与不同动物的IgG结合,其中与人和猪IgG的结合能力相对较高,但不同血清型猪链球菌SSPG与同种动物IgG的结合活性没有明显差异。实验将猪链球菌2型的SSPG以腹腔注射的方式刺激小鼠脾细胞,并将SSPG与具有较强免疫保护性的溶血素蛋白(SLY)和溶菌酶释放蛋白(MRP)混合免疫小鼠后检测免疫保护力,实验结果显示SSPG并非超抗原物质,虽然可以引起机体产生较强的抗体水平,但可能并不是免疫保护性蛋白,同时可能抑制了免疫保护性抗原的保护力水平。2.猪链球菌2型SSPG基因缺失突变株的构建及其生物学特性猪链球菌在感染过程中逃避宿主免疫系统的监视和吞噬,并对抗宿主免疫应答的机制对研究猪链球菌的致病机理具有十分重要的意义。金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)等IgG结合蛋白都被证明与病原菌的致病性具有密切联系,且大多与病原菌逃避宿主的免疫监视有关。为了进一步探求SSPG是否如一些报道中预测一样能够影响猪链球菌的致病性,实验利用温度敏感型载体pSET4s,进行链球菌的重组,将猪链球菌2型的SSPG基因敲除,构建了SSPG基因缺失的链球菌突变株。对突变菌株的生物学特性分析显示,突变菌株的细胞壁结构在透射电镜的观察下界限较为模糊,但其表面形态、溶血活性、生化特性以及染色特性等与野生菌株相比均无明显差异。细菌生长曲线的绘制结果表明突变菌株生长的衰亡期出现较早,SSPG的缺失可能影响了细菌生长的稳定性。小鼠攻毒实验的结果表明SSPG基因的缺失对猪链球菌的致病性没有显著影响,但可能影响了猪链球菌在宿主脾脏内的定植。