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研究目的
1.研究姜黄素抗三氧化二砷(As2O3)诱变性的作用及其剂量效应。2.研究单用姜黄素及与As2O3合用抑制人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC7901生长并诱导人宫颈癌细胞HeLa凋亡的作用,及其对HeLa细胞生长周期的影响。
3.探讨姜黄素抗突变、抗肿瘤作用,为研制开发抗诱变药品和保健品以及临床上联用姜黄素与As2O3抗肿瘤治疗提供实验依据。
研究方法
1.姜黄素抗As2O3的诱变性研究
(1)小鼠骨髓细胞微核(MN)实验。各组分别用色拉油或各浓度姜黄素溶液连续灌胃7天后,腹腔注射生理盐水或As2O3溶液,处死前4h各组腹腔注射秋水仙素液。直接涂片法制片,染色后双盲法阅片,计数1000个嗜多染红细胞,并记录含有MN的嗜多染红细胞数,计算MN率。
(2)体外人外周血淋巴细胞MN实验。无菌操作培养人外周血淋巴细胞24h后,各组分别加入各浓度As2O3溶液及(或)姜黄素溶液。44h后加入秋水仙素液,继续培养4h,空气干燥法制片。染色后双盲法阅片,计数含有1000个淋巴细胞,并记录含有MN的淋巴细胞数,计算MN率。
2.姜黄素和As2O3联用诱导细胞凋亡的研究
(1)姜黄素与As2O3对SGC7901和HepG2两种细胞株生长和凋亡的影响。取培养至对数生长期的SGC7901及HepG2细胞分别接种于96孔培养板,培养24h后,各组加入无血清培养基或各浓度As2O3溶液及姜黄素溶液。加药24h后,在光镜下观察各组细胞的生长状态,采用MTT法检测各孔的光密度(OD)值,并计算生长抑制率。
(2)姜黄素与As2O3对HeLa细胞凋亡率及细胞周期的影响。取培养至对数生长期的HeLa细胞接种于24孔培养板,培养24h后,各组加入无血清培养基或各浓度As2O3溶液及姜黄素溶液;加药24h后,在光镜下观察各组细胞的生长状态,采用流式细胞仪(FCM)碘化丙啶(PI)单染法检测单用姜黄素及As2O3合用对HeLa细胞凋亡率及其细胞周期的影响,计算凋亡率。
研究结果
1.小鼠骨髓细胞MN实验
As2O3组小鼠骨髓细胞的MN率最大;As2O3+中浓度姜黄素组,小鼠骨髓细胞的MN率最低。与空白对照组比较,As2O3+中、低浓度姜黄素组有显著性差异(p<0.05),As2O3组及As2O3+高浓度姜黄素组均有更显著性差异(p<0.01)。
2.人外周血淋巴细胞MN实验
各浓度As2O3组随As2O3浓度的增加,人外周血淋巴细胞的MN率增大。与空白对照组比较,各浓度As2O3组有显著性差异(p<0.01)。与1μg/ml组比较,10μg/ml姜黄素组+1μg/mlAs2O3有显著性差异(p<0.05),20μg/ml姜黄素组+1μg/mlAs2O3有更显著性差异(p<0.01);与2μg/mlAs2O3组比较,10μg/ml姜黄素组+2μg/mlAs2O3有显著性差异(p<0.05),20μg/ml姜黄素组+2μg/mlAs2O3有更显著性差异(p<0.01);与4μg/mlAs2O3组比较,20μg/ml+4μg/mlAs2O3姜黄素组有显著性差异(p<0.05),10μg/ml姜黄素组+4μg/mlAs2O3有更显著性差异(p<0.01)。
3.药物对癌细胞形态的影响
光镜下观察发现,As2O3组及As2O3+各浓度姜黄素组均可见部分SGC7901、HepG2及HeLa细胞变小变圆,出现颗粒状物质等细胞凋亡的形态改变。
4.药物对癌细胞生长的抑制作用
MTT法检测结果表明,姜黄素组中40μmol/l姜黄素对细胞SGC7901及HepG2的生长抑制率最大;As2O3组随As2O3浓度增加对细胞SGC7901及HepG2的生长抑制率增大,姜黄素与As2O3合用可增加单用对细胞SGC7901及HepG2的生长抑制率。与空白对照组比较,5、10μg/ml姜黄素组,5μg/mlAs2O3组,5μg/ml姜黄素+0.5μmol/lAs2O3组对SGC7901细胞有显著差异(p<0.05),其余各组均有更显著性差异(p<0.01)。5μg/ml姜黄素+0.5μmol/lAs2O3组对HepG2细胞有显著差异(p<0.05),其余各组均有更显著性差异(p<0.01)。
5.药物对癌细胞凋亡和细胞周期的影响
流式细胞术检测结果表明,各浓度姜黄素组、As2O3与各浓度姜黄素合用组随姜黄素浓度增加,HeLa细胞的凋亡率越大。与空白对照组比较,5μg/ml姜黄素组有显著性差异(p<0.05),其余各组均有更显著性差异(p<0.01)。此外,与空白对照组相比,As2O3组及As2O3+各浓度姜黄素组均使G0/G1期细胞数量明显增加,S期细胞明显减少,细胞周期被不同程度地阻滞于G1期。
研究结论
1.As2O3具有致突变的作用,并呈现一定的量效关系。
2.姜黄素具有显著的抗As2O3诱变性的作用。
3.各浓度As2O3及各浓度姜黄素均可抑制SGC7901、HepG2细胞的生长,诱导HeLa细胞的凋亡,并呈一定的量效关系。
4.各浓度姜黄素与As2O3合用可增强其单独应用抑制SGC7901、HepG2细胞生长及诱导HeLa细胞凋亡的作用。
5.姜黄素及As2O3对HeLa细胞的增殖周期有影响,它可阻滞其细胞周期于G1期,并呈一定的量效关系。