ECO-0501是从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中分离出的聚酮类化合物。ECO-0501作为一种新型结构抗菌物质对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性包括一些耐药菌如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)。其独特的抗菌机制是通过快速干扰细菌细胞膜从而导致对胞内大分子合成瞬时及整体的影响。ECO-0501的药物靶点主要针对细菌,体内毒性小,且不易产生耐药菌,目前正处于临床前的研究,作为新型抗生素开发有很大的前景。本课题针对本实验室构建的一株工程菌东方拟无枝酸菌dA9,从基因水平上对ECO-0501生物合成途径中的关键基因进行了研究并在此基础上利用基因工程的技术手段对工程菌的生产性状进行了改良。具体而言,本论文主要做了以下工作：1.东方拟无枝酸菌粘粒文库中ECO-0501生物合成基因簇的筛选通过菌落原位杂交的方法对东方拟无枝酸菌基因组粘粒文库进行了筛选。通过PCR和基因测序验证得到了四个可以覆盖整个ECO-0501生物合成途径的粘粒克隆：NL5B、NL9-3-1、NL3-1C及NL3-3A。2.调控基因ECO-orf4功能的研究通过对基因ECO-orf4编码蛋白序列的生物信息学分析,ECO-orf4属于LAL家族蛋白。因此推测ECO-orf4是ECO-0501合成途径的特异性正调控蛋白；ECO-orf4基因敲除及互补试验结果显示ECO-orf4是合成ECO-0501过程中必需的关键基因。通过ECO-orf4的过表达试验证实ECO-orf4具有正调控作用,但是ECO-orf4作为LAL家族蛋白在调控ECO-0501合成时其转录水平可能存在阈值。当ECO-orf4的转录水平在阈值范围内时,多拷贝的ECO-orf4会促进ECO-0501的合成,否则会产生反效果。通过对东方拟无枝酸菌ECO-0501合成相关基因的RT-PCR分析发现,ECO-orf4的缺失导致ECO-0501合成相关基因转录水平的大幅降低,致使无法开启ECO-0501的合成。由于缺少调控蛋白ECO-orf4及其调控区域DNA的相关数据,我们无法确定ECO-orf4具体的调控位点,但是可以确定ECO-orf4是ECO-0501生物合成过程中必需的正调控蛋白。3.Ⅱ型硫酯酶基因ECO-orf27功能的研究通过对基因ECO-orf27编码蛋白序列的生物信息学分析,ECO-orf27属于Ⅱ型硫酯酶。ECO-orf27基因敲除及互补试验结果显示ECO-Orf27是合成ECO-0501过程中非必需的关键基因。ECO-orf27与Ⅰ型硫酯酶基因及pikAV的交叉互补试验表明其是与Ⅰ型硫酯酶基因不同的Ⅱ型硫酯酶基因。通过ECO-orf27的过表达试验进一步证实ECO-orf27是ECO-0501生物合成过程中的关键酶,可以通过提高ECO-orf27的表达水平来提高ECO-0501的产量。4.产去甲基ECO-0501工程菌的构建对东方拟无枝酸菌基因敲除的方法进行了改进,在单交换整合过程中引入I-SceI位点,通过在单交换突变株中I-SceI的表达,促使双交换效率提高到自发效率的19倍；利用此方法对ECO-0501生物合成途径中的N-甲基转移酶进行了敲除,得到了只产去甲基ECO-0501工程菌,其产量是A.orientalis dA9的3.6倍。综上所述,本论文首次对东方拟无枝酸菌ECO-0501生物合成途径中的关键基因ECO-orf4,ECO-orf27的功能进行了研究,并通过基因工程的方法改良了菌株的生产特性,得到了生产去甲基ECO-0501的工程菌。