黑皮质素受体(melonocortin receptors,MCR)参与调节生物体许多生理行为,包括能量平衡、色素沉降、性行为、炎症、心脑血管功能、进食行为、皮脂腺脂肪分泌等等。它是G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR)的一个亚家族,具有七次跨膜结构。已知五种黑皮质素受体亚型,分别为MC1R、MC2R、MC3R、MC4R以及MC5R。其中,MC4R的激动剂在治疗肥胖症以及性功能障碍等方面密切相关,有潜在的应用价值。　　Bremelanotide(PT-141)是美国Palatin公司研发的一种用于治疗男女性功能障碍的环七肽MC4R激动剂,其鼻喷剂由于升高血压的副作用被美国FDA拒绝批准进入III期临床实验;而研发者认为,少数受试者出现的血压升高的副作用可能是由于鼻喷剂带来的药物吸收浓度过高引起的,随后进行的皮下注射给药I期临床实验没有发现血压升高副作用。他们计划进行皮下注射给药的II期临床实验来进一步验证这种推测。此外,PT-141及其酰胺类似物MT-II以及礼来公司研发的一系列黑皮质素类二硫桥环肽在治疗肥胖症方面展示了较好的生物活性。　　本课题的主要目的就是在文献调研和课题组前期工作的基础上,以PT-141、MT-II及礼来公司研发的Ac-DArg-c(Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys)-NH2为阳性对照,寻找新型MC4R激动剂,为新药研发打下基础。同时对黑皮质素类似物的构效关系进行研究,并进一步考察黑皮质素类似物和黑皮质素受体的相互作用机理。　　结合文献和本实验室前期工作,在构效关系研究的基础上,本课题设计合成了环肽、线型肽以及小分子三大类共45个目标化合物。其中,环肽30个,线型七肽2个, C端修饰四肽11个,小分子2个。环肽又分为含有N-取代甘氨酸(NSG)单体的环肽、不同位置成环的环肽以及生物素选择性修饰的环肽;线型四肽主要是围绕黑皮质素类似物的药效团“His-D-Phe-Arg-Trp”、在C端引入了一系列脂肪性或芳香性基团;小分子类似物也是基于药效团,以哌嗪为骨架,设计了2个药效团的小分子模拟物。这些结构均未见文献或专利报道。　　根据课题设计的需要,本文合成了5个保护的非天然氨基酸单体,其中有四个芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl,Fmoc)保护的NSG衍生物,一个Fmoc保护的生物素修饰的4-胺基-D-苯丙氨酸(Fmoc-D-Aph(Biotin)-OH)。其中后者未见文献报道。在进行了多种缩合试剂以及反应条件的摸索后,找到了一条收率较高的合成路线。所有目标单体都通过氢谱、质谱、熔点测定等手段进行了鉴定和表征。　　根据结构类型不同,对目标化合物的合成我们采取了相应的合成策略。对于酰胺键成环的环肽目标化合物,我们采用常规的逐步固相多肽合成方法手动合成;对于二硫键成环的环肽目标化合物,我们采用固相合成线型肽前体、液相成环的方法;对C端修饰的四肽,我们首先利用2-氯-三苯甲基氯树脂,通过固相合成得到全保护的四肽片段,然后液相与各种胺基试剂反应,最后脱除保护基并进行纯化;对于小分子化合物的合成,我们采用类似多肽液相缩合的方法。利用中压C18反相色谱对所有目标化合物进行了纯化,最后冷冻干燥得到产物。利用ESI-MS进行了分子量鉴定。　　黑皮质素类似物的生物活性评价通常采用放射性配体受体结合实验以及刺激细胞释放环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的功能实验。前者评价化合物与受体的亲和力,后者评价化合物的激动/拮抗活性。通过与放射性配体I125-α-黑素细胞刺激激素( I125-α-melanocyte stimulating hormone, I125-α-MSH)竞争结合受体的实验方法,以SD大鼠脑组织提取的富含MC4R的膜蛋白为靶标,对设计合成的45个黑皮质素类似物分别在10nM和100 nM两个浓度下进行了MC4R亲和力的筛选。结果发现,在100nM浓度下,有15个化合物抑制率达到了50％;在10nM浓度下,有6个化合物抑制率达到了50％,与阳性对照相当。其中,LK-FS-G11与LK-FS-B01在两个浓度下都显示了与阳性对照相当的受体亲和力。　　初步构效关系表明:1)将成环位置氨基酸替换为含有相同侧链官能团的NSG单体,在一定程度上保留了MC3R和/或MC4R亲和力;2)环肽对MC3R和/或MC4R的亲和力大于相应的线肽,MT-II中成环位置改变将导致MC3R和/或MC4R亲和力下降;3)N端生物素修饰,基本保持MC3R和/或MC4R亲和力,D-Phe4位置引入生物素,导致亲和力丧失;4)在含二硫桥的环肽中,His替换为Tal或Mtal可能会导致MC3R和/或MC4R亲和力下降;5)Nle用Aca替换或去除后可能会导致MC3R和/或MC4R亲和力降低;6)D-Phe4替换为D-Cpa可能会提高MC3R和/或MC4R亲和力;7)N端引入含羧基的极性基团,可能会导致MC3R和/或MC4R亲和力降低;8)在100nM以及10nM水平,小分子和C端修饰四肽对MC3R和/或MC4R亲和力较弱。　　由于受体亲和力评价使用的是大鼠脑组织,其中富含MC4R和MC3R两种受体,因此得出的结果是作用于MC3R和/或MC4R的亲和力。化合物的单一MC4R亲和力以及功能活性还需要进一步的实验来评价。　　本课题为寻找高活性MC4R激动剂、开发有自主知识产权的新型黑皮质素类药物打下了一定的基础。