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光皮桦(Betula luminifera)是主要分布在我国南方的珍贵用材树种,材性优良,是林木遗传育种研究的良好材料。miR166在植物顶端分生组织发育、维管组织的形成、胚的发育中具有重要作用,其对靶基因HD-ZIP Ⅲ转录因子的调控是维管组织发育的重要途径。鉴定miR166及HD-ZIP Ⅲ转录因子基因家族成员,并研究其功能,可为光皮桦木材形成机制和遗传改良提供重要的理论基础。本研究以光皮桦为材料,对miR166及其靶基因HD-ZIP Ⅲ的家族成员进行了鉴定,并通过表达及转基因分析对其功能进行了研究,获得以下主要结果。1.根据光皮桦转录组及部分基因组数据,鉴定并克隆得到8个miR166前体序列,命名为BlmiR166a~BlmiR166g,序列长为0.3Kb~2.4Kb。对8个miR166和靶基因Bl HDZ Ⅲ进行了基因结构、顺式作用元件与系统进化等生物信息学分析,结果显示BlmiR166b、BlmiR166c与BlmiR166e含有1个内含子,其它miR166在基因组上则不含内含子。5个靶基因除了Bl HDZ1有19个外显子,其他Bl HD-ZIP Ⅲ基因都由18个外显子组成。对所有基因的顺式元件统计显示,光启动元件出现次数最多。系统进化分析表明,光皮桦8个miR166成熟体全部在同一个分支,而在前体序列比对中,8个pre-miR166分布在3个不同的亚组。2.组织表达特性分析表明,在所有miR166中,只有BlmiR166a和BlmiR166h在韧皮部表达量高,可能与其含有维管束发育相关元件有关;而BlmiR166d、BlmiR166e的表达十分相似,都是在芽中有高丰度的转录水平;BlmiR166b、BlmiR166c和BlmiR166f的表达较为相似,在雄花中表达量高;BlmiR166g则是在芽、雌花、雄花等组织都有表达。我们发现所有Bl HD-ZIP Ⅲ基因在韧皮部、种子和根中表达量都很低。Bl HDZ2和Bl HDZ5的表达情况相似,在木质部中的表达量远高于其他组织,暗示其参与了木质部的发育。Bl HDZ3和Bl HDZ4在茎中的表达丰度很高,且成熟茎段的明显高于幼嫩茎段。Bl HDZ1则在顶端分生组织中表达丰度高,表明其参与到了分生组织的发育中。此外,发现部分miR166与HD-ZIP Ⅲ间的表达呈现负调控。如BlmiR166a和BlmiR166h在木质部中几乎不表达而在韧皮部中表达量高,而靶基因Bl HDZ2和Bl HDZ5的表达正好相反。这表明这些基因在木质部与韧皮部的生长发育中存在负调控关系。3.Bl HD-ZIP Ⅲ基因在不同激素处理下的表达情况进行研究发现,5个Bl HD-ZIP Ⅲ基因在0.1m M浓度的IAA处理下都明显的受到诱导调控,其表达量与对照相比显著上调。这暗示Bl HDZⅢ基因与激素IAA参与了调控木质部的发育。Bl HDZ1、Bl HDZ3和Bl HDZ4分别在IAA、ET和GA的诱导下上调明显,可能与所含激素类相关顺式元件有关。Bl HDZ2和Bl HDZ5只有在0.1m M IAA处理下表达量有所增加,而在其他激素处理下变化不大。4.构建了5个Bl HDZⅢ基因的超表达载体并利用农杆菌介导法转化拟南芥,在分子水平进行了目的基因和报告基因的PCR检测,成功将Bl HDZ1、Bl HDZ2、Bl HDZ4和Bl HDZ5转到拟南芥中,其中Bl HDZ1和Bl HDZ5得到T2代各8个株系,Bl HDZ2和Bl HDZ4得到T2代各2个株系。发现与拟南芥野生型相比,Bl HDZ4和Bl HDZ5在表型性状上有一定的差异,这些基因的具体功能还有待于后续的深入研究。