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研究目的广藿香为唇形科刺蕊草属Pogostemon cablin(Blanco)Benth的干燥地上部分,是我国胃肠道疾病的传统用药,具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑的功效[1]。广藿香醇(Patchouli alcohol,PA),是广蕾香油中含量最高,研究最多的三环倍半萜类活性单体成分[2,3]。国内外研究发现广藿香醇具有胃肠保护、抗炎、维持肠道菌群稳态等生物活性[4-6],其中胃肠道保护作用研究是其研究重点。课题组前期研究发现,广藿香醇具有抗乙醇和吲哚美辛诱导的胃溃疡以及葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎的作用[7,8]。肠道黏膜炎(Intestinal mucositis,IM),也称为肠道黏膜屏障损失,是肿瘤患者化疗过程中主要的剂量限制性不良反应[9],主要临床表现为恶心,呕吐,腹泻,食欲减退、消化吸收不良等一系列胃肠道反应[10,11]。肠道黏膜炎具有发病率高、危害大的特点,常引起肠溃疡、腹泻、出血、疼痛等症状。这些症状会严重影响到肿瘤患者的治疗和生活,增加患者的感染率和死亡率。因此对其研究显得刻不容缓,但是目前并没有特异性药物能够根治肿瘤化疗引起的肠黏膜炎这一毒副作用。于是我们将研究方向投向于传统中医药,尝试从我国丰富的中药资源中挖掘出具有潜在治疗作用的药物。广藿香是我国胃肠道疾病的传统用药。课题组前期关于广藿香醇抗溃疡性结肠炎的研究中发现[8],广藿香醇可以缓解肠炎症状,例如腹泻、体重下降等,进一步研究发现广藿香醇促进肠屏障功能的恢复。肠黏膜炎的临床症状与溃疡性结肠炎相似,且肠屏障功能受损是致使肠黏膜炎发生的重要原因。因此我们推测广藿香醇可能具有治疗肠黏膜炎的活性作用。本实验将从肠屏障功能角度探讨广藿香醇抗肠黏膜炎的作用机制,为广藿香醇治疗肠黏膜炎提供科学依据。方法将实验动物随机分为正常组,模型组,阳性组和给药组。在实验开始的第1-4天,除了正常组的大鼠每天腹腔注射(intraperitoneal injection,i.p.)生理盐水,其余各实验大鼠每天腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-influorouracil,5-FU,30mg/kg)建立实验性肠黏膜炎模型。在实验期间,正常组(Normalgroup)和模型组(5-FU group)动物灌胃生理盐水,阳性组灌胃金双歧(CBL,400mg/kg),给药组则灌胃广藿香醇(PA,10、20、40 mg/kg)共7天。每天观察和记录实验动物的排便状况、体重和饲料食用情况。实验结束后,通过分析各组动物的体重、食用饲料量以及腹泻情况的变化,以及组织病理学变化初步评价广藿香醇治疗肠黏膜炎的疗效。收集实验动物的肠道内容物,提取总DNA,检测样品的16S rDNA可变区PCR产物的序列,拼接成Tags。根据Tag进行物种分类、丰度分析、OTU分析、聚类分析等,观察组间差异,研究广藿香醇对肠道微生物多样性和菌群分布等方面的影响。收集实验动物的小肠组织,用PAS和IHC染色方法检测小肠组织中杯状细胞和黏蛋白-2的表达;RT-PCR方法检测小肠组织中MLCK、ZO-1、Occludin及Claudin-1的mRNA表达差异;Western blot方法检测小肠组织中NF-κB p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、ZO-1、Occludin、Claudin-1等相关蛋白;用Elisa方法检测组织中相关炎性和氧化指标(TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、sIgA 和 MPO)。结果常规结果显示:模型组大鼠体重和饲料食用量一直下降,腹泻日益严重;阳性组大鼠体重和饲料食用量在实验后期有着显著的增长,腹泻情况有所改善;广藿香醇组大鼠与阳性组大鼠表现类似,体重和腹泻减轻状况,饮食状态恢复,呈剂量依赖性。组织病理检测结果显示:5-氟尿嘧啶严重破坏大鼠小肠组织,致使小肠组织部分坏死,黏膜萎缩,腺体残缺等;阳性组大鼠小肠组织完整度较高,没有坏死区域;广藿香醇对大鼠小肠组织的保护呈剂量依赖性,广藿香醇高剂量组大鼠小肠组织比较完整,腺体排列整齐,广藿香醇低剂量组大鼠小肠组织则受损严重,腺体排列紊乱。肠道菌群分析结果表明:5-氟尿嘧啶破坏大鼠体内肠道菌群稳态和组成多样性;CBL和广藿香醇可提高肠黏膜炎大鼠体内的OTU数目,恢复肠道菌群的组成。此外,高剂量广藿香醇还能够抑制致病菌(例如拟杆菌、副杆菌、幽门螺旋杆菌)的生长,并促进益生菌(例如双歧杆菌、乳酸杆菌)的生长。PAS和IHC染色结果表明:5-氟尿嘧啶显著降低大鼠体内杯状细胞和黏蛋白-2的IOD,CBL可有效提高杯状细胞和黏蛋白-2的IOD。广藿香醇组杯状细胞和黏蛋白-2的IOD提高作用呈剂量依赖性,广藿香醇高剂量组杯状细胞和黏蛋白-2的IOD高于阳性组,即广藿香醇高剂量组的效果最好。RT-PCR结果显示:5-氟尿嘧啶抑制大鼠体内MLCK、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表达,CBL能够分别恢复MLCK、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA异常表达。广藿香醇组中以高剂量组的恢复效果为最好,能显著提高MLCK、ZO-1、Occludin和 Claudin-1 的 mRNA 表达。Western blot检测结果表明:5-氟尿嘧啶激活大鼠TLR2/MyD88/NF-κB通路,破坏肠上皮细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达;CBL和广蕾香醇可以有效抑制肠黏膜炎大鼠小肠组织中TLR2/MyD88/NF-κB相关蛋白的表达,同时恢复ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达,其中广藿香醇的恢复效果呈剂量依赖性。ELISA结果显示:模型组大鼠小肠组中TNF-α、IL-lβ、IL-6、sIgA、MPO表达过高,IL-4、IL-10表达较低,CBL和广藿香醇能够降低小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、sIgA、MPO的表达水平,同时提高IL-4、IL-10的表达水平,其中广藿香醇高剂量组的作用最为显著。结论广藿香醇有效改善化疗诱导的肠黏膜炎模型大鼠的病症,减缓肠道炎症反应,改善腹泻状况,恢复体重和饮食,其作用机制与保护肠屏障功能,维持肠道菌群微生态的稳定,改善肠上皮通透性以及抑制TLR2/MyD88/NF-κB通路相关,提示广藿香醇在化疗诱导的肠道黏膜炎方面具有潜在的应用价值。