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研究目的:制备一种基于肽电荷反转的智能靶向、可用于肿瘤荧光成像与抗肿瘤药物递送一体化的介孔二氧化硅纳米探针(YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX),进行体外及体内研究,以评估其靶向性成像效果及在治疗中的作用。研究方法:1.纳米探针的制备及表征:制备YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针,用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)及激光散射粒度仪进行表征;采用透析法测定纳米探针的体外药物释放行为,计算抗肿瘤药物(盐酸阿霉素,DOX)的包封率和载药率;荧光显微镜下观察YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针在不同pH值条件下的荧光;傅里叶红外光谱仪测绘纳米探针的红外光谱曲线;热重分析仪计算纳米探针中各成分所占比重;利用比表面积和孔径分布分析仪测量纳米探针的比表面积和孔径。2.纳米探针的体外靶向性及细胞毒性研究:用制备的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针分别与MCF-7细胞和HEK293细胞共同孵育,用CCK-8实验检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡,共聚焦激光显微镜(CLSM)观察纳米探针的细胞摄取。3.纳米探针在体成像及疗效研究:建立MCF-7裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分为治疗组及成像组。治疗组分为四组,每次治疗前测量肿瘤的长与宽,称量裸鼠体重。实验终点时,取血20 μL进行血常规检查,然后将裸鼠处死,离体肿瘤及脏器,进行组织病理HE染色;肿瘤组织予TUNEL及CD31免疫组化检测。成像组分为三组,利用近红外荧光成像仪进行荷瘤鼠活体及离体肿瘤、器官荧光成像。研究结果:1.纳米探针的制备及表征:制备的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针呈球形,粒径约50 nm。DOX的载药量为8.6±1.4% ,包封率为39.3 ±3.5%。在pH 5.0的PBS中,纳米探针中的DOX释放速度最快,10小时释放约34.5 ± 3.6%,与在pH 6.5 PBS中的释放19.7 ± 2.4%比较,差异有统计学意义(p<0.05),与pH 7.4 PBS中释放10.5 ±2.1%比较,差异有统计学意义(p<0.01)。荧光显微镜下观察显示,YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针在中性PBS液(pH 7.4)中荧光很弱,荧光强度比值为15.7 ± 3.8%,在碱性PBS液(pH 8.0)中未观察到荧光,荧光强度比值为7.3 ± 1.8%,而在酸性PBS液(pH 5.5及6.5)中,观察到明显的绿色荧光,荧光强度比值分别为74.3 ± 10.5%%和56.8 ± 8.7%。热重分析检测结果显示 CPTS、TAT-FITC、Cit、YSA-BHQ1、DOX 在 YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针中所占重量比例分别为7.2 ± 2.4%、14.4± 4.1%、6.7±1.9%、14.6±4.5%、8.2±2.7%。YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX 纳米探针的比表面积、介孔容积和介孔直径分别为157.4±23.1m2/g、0.27±0.07mL/g和0.7±0.15 nm,较 MSN 的比表面积 496.7 ± 56.4m2/g、介孔容积 0.98± 0.24mL/g和介孔直径2.2 ±0.8 nm均明显减少,差异有统计学意义(p<0.01)。2.纳米探针的体外靶向性及细胞毒性研究:CCK8实验结果显示,DOX浓度为0.1 μg/mL的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针作用于MCF-7细胞的存活率为69.7±9.8%,游离DOX组为80.5±8.3%,两组比较差异无统计学意义(p>0.05),且细胞活性随DOX浓度增加逐渐减小,呈浓度依赖性。DOX浓度为0.1μg/mL的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX纳米探针作用于HEK293细胞的存活率为96.5 ± 11.8 %,游离DOX组为78.1 ± 9.6%,两组比较差异有统计学意义(p<0.05),细胞活性随DOX浓度增加逐渐减小,呈浓度依赖性。流式细胞仪检测结果显示,YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX组纳米探针引起MCF-7细胞凋亡的比例为51.8 ± 9.2%,高于游离DOX组的41.2 ± 8.4%,两组比较差异无统计学意义(p>0.05);引起HEK293细胞凋亡的比例为11.3±1.8%,与游离DOX组39.3±6.5%比较,差异有统计学意义(p<0.05)。纳米探针细胞摄取结果显示,YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX和游离DOX进入MCF-7细胞内的量均较多。YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX进入EK293细胞和经过YSA肽预处理的MCF-7细胞内的量均很少。3.纳米探针在体成像及疗效研究:荷MCF-7细胞瘤裸鼠实验显示,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX组对裸鼠肿瘤生长抑制作用优于游离DOX组,治疗21天后,肿瘤体积为412.7±73.5mm3,肿瘤重量为0.35±0.09g,游离DOX组肿瘤体积为578.4 ±40.7 mm3,肿瘤重量为0.58 ±0.16 g,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。治疗 21 天后,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组裸鼠体重为27.4 ± 8.6 g,游离DOX组裸鼠体重为18.5 ±4.3 g,两组比较差异有统计学意义(p<0.01); YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组血白细胞数为 7.5±1.8×109/L,游离DOX组血白细胞数为4.2±].7×109/L,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX组裸鼠器官组织病理HE染色未观察到明显组织损伤。近红外成像结果显示YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX纳米探针经裸鼠尾静脉注射后没有在尾部显影,在注射后1小时开始在肿瘤部位显影,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX组肿瘤/正常组织荧光强度比值(T/N)为 3.13 ± 0.74,与 TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组 1.73 ± 0.57 及游离 Cy5.5 组 1.64± 0.48比较,差异均有统计学意义(p,0.05)。注射后12小时,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组肿瘤/正常组织 T/N 为 4.06 ± 0.88,与 TAT-Cy5.5/MSN@DOX组0.97 ± 0.28及游离Cy5.5组0.82 ± 0.21比较,差异均有统计学意义(p<0.01)。注射后24小时,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX组肿瘤部位荧光亮度达到高峰,YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX组肿瘤/正常组织T/N为4.93±0.79,与TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组 1.06 ± 0.25 及游离 Cy5.5 组 1.38 ± 0.31 比较,差异均有统计学意义(p<0.01)。第 48 小时 YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX 组肿瘤/正常组织T/N为4.01 ± 0.59,与TAT-Cy5.5/MSN@DOX组 1.04±0.28及游离Cy5.5组1.82±0.45比较,差异均有统计学意义(p<0.01)。研究结论:成功制备了一种可用于肿瘤荧光成像与抗肿瘤药物递送一体化的介孔二氧化硅纳米探针(YSA-BHQ1/TAT-FITC(Cy5.5)/MSN@DOX)。该纳米探针能通过EphA2受体介导的途径大量进入MCF-7细胞,引起细胞凋亡;而对HEK293细胞毒性作用较小。标记有Cy5.5的纳米探针YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX能特异性地靶向MCF-7肿瘤,并且在裸鼠肿瘤部位长时间滞留,对肿瘤生长有明显的抑制作用,而对正常器官组织毒副作用较小。YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX纳米探针经裸鼠尾静脉注射后在正常组织和血液循环中荧光背景极低,在肿瘤部位荧光较强,可获得最大的肿瘤/正常组织T/N。以上结果表明,该一体化纳米探针能够靶向到肿瘤部位,在肿瘤部位成像,抗肿瘤作用明显,对正常组织或细胞损伤较小,在抗肿瘤诊治方面有很大的应用潜力。