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MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码的小分子单链RNA,长约19-23碱基。MiRNA通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’-UTR)结合抑制靶基因的翻译或导致靶基因mRNA的降解,从而在转录后水平调控基因的表达。大量的研究表明,miRNAs不但参与生物体多种基本生命过程的调控,它还与疾病的发生发展存在千丝万缕的联系,在生命活动中起着非常重要的作用。但是,与新的miRNA的频频发现相比,miRNA功能及应用方面的研究却相对缓慢。本论文主要就以下六个方面对miRNA功能进行研究:第一方面是成熟miRNA功能的鉴定及其对疾病的影响;第二方面是miRNA在细胞核的存在及其作用方式和功能;第三方面是miRNAs在线粒体的存在及其可能的生物学功能;第四方面是血清/血浆miRNA作为非侵入地诊断诊断标志物方面的研究;第五方面是血清/血浆miRNA稳定的机制,第六方面是miRNAs对免疫抑制细胞的影响。主要研究成果如下:1.miRNA-214通过抑制PTEN的表达而延迟单核细胞凋亡。我们研究发现了 miR-214以及它的靶基因在晚期糖基化终产物(AGE)诱导的单核细胞凋亡延迟中的作用。通过利用miRNA芯片和茎-环qRT-PCR研究了 AGEs处理/不处理的单核细胞系THP-1 miRNA表达谱,发现miR-214在AGE处理的THP-1和人外周血单核细胞中都是显著升高的,并且AGE诱导的单核细胞miR-214表达的升高很可能是通过AGEs的受体的。另外,我们发现在AGEs含量很高的慢性肾衰竭病人的单核细胞中miR-214也是显著升高的。然后,通过靶点预测和荧光素酶报告基因实验我们进一步发现miR-214能够和PTEN mRNA的3’UTR特异性的结合,表明PTEN是miR-214的一个靶基因。通过比较正常单核细胞、AGE处理的单核细胞核慢性肾衰竭病人的单核细胞发现PTEN的降低可以延迟单核细胞的凋亡。在THP-1中过表达miR-214抑制PTEN的表达也延迟THP-1细胞的凋亡,而抑制miR-214表达则基本上消除了 AGEs诱导的细胞凋亡的延迟。2.证明miR-709在细胞核中直接在转录后水平调节miR-15a/16-1的生成首次证明miR-709主要存在于多种细胞的细胞核中并且其在细胞核的分布随着凋亡的刺激而迅速发生改变。另外,miR-709在细胞核中直接和pri-miR-15a/16-1上的19-nt的高度互补序列结合从而抑制pri-miR-15a/16-1加工成为pre-miR-15a/16-1导致miR-15a/16-1成熟的减少。更重要的是,miR-709还通过miR-16-1/Bcl2通路参与细胞凋亡的调节。我们的研究是对miRNAs经典的作用方式的一个补充。3.首次发现小鼠肝脏线粒体相关的miRNAs以及它们可能的生物学功能尽管我们已经在细胞核中发现了成熟的miRNAs,但是诸如线粒体的细胞器中是否有特定的miRNAs还不是很清楚。我们通过microRNA微阵列芯片技术在基因组水平分析miRNAs表达谱并且通过茎环miRNA的qRT-PCR方式进行验证,发现了线粒体中特异并且富集的miRNAs——miR-705、miR-202-5p、miR-134,这些线粒体miRNAs可能参与调节线粒体基因的表达以及其他细胞过程,例如:细胞凋亡、增殖和分化。4.首次证明血清miRNA能够作为HBV感染和HBV阳性的肝细胞癌诊断标志物近年来,发现miRNA除了存在于细胞或组织(细胞质、线粒体、细胞核、p body)中,在人的血清、血浆等体液中也存在大量的miRNAs,并且这些miRNAs能够反映一定的生理状态。我们搜集了513个血清标本(210例正常对照、135例HBV感染、48例HCV感染、120例HCC感染),利用Solexa测序初筛和qRT-PCR验证的实验策略以期找到乙肝及相关疾病的标志miRNAs。首先,由于慢性乙肝和肝细胞癌之间的密切关系,我们比较了正常对照血清和乙肝患者血清miRNAs表达谱,得到了 13个HBV异常表达的miRNAs。这13个miRNA标志物不仅能够准确将HBV和正常对照、HCV区分开,也能将HBV阳性的HCC和正常对照及HBV区分开。其次,我们还直接比较了正常对照和肝细胞癌的miRNA表达谱,发现6个miRNAs在肝细胞癌血清样本中是显著升高的,有意思的是,这些miRNAs中的两个miRNA:miR-375和miR-92a也是HBV特异的。5.发现Ago2选择性地保护MVs中的miRNAs并且介导其功能循环miRNAs具有很高的稳定性,它能够作为多种疾病的生物标志物或者在细胞之间充当信号分子的作用。然而,循环miRNAs稳定的机制到目前为止还不是很不清楚。我们研究发现Ago2蛋白复合物能够选择性地保护MVs中的miRNAs,并且能介导与之结合的miRNAs功能。6.发现miR-155和miR-21可能介导骨髓来源的免疫抑制细胞MDSC的增殖、激活及功能最后我们又将研究回归到miRNAs最本质的问题上——通过调节蛋白表达来发挥功能,通过研究我们发现不管是小鼠骨髓或者是人的细胞系体外诱导还是肿瘤小鼠的骨髓来源的抑制细胞产生过程中miR-155和miR-21表达量都是增加的,提示这两个miRNAs在MDSC增殖、激活和发挥功能过程中是有潜在作用的。目前该研究还处于起步阶段,我还将作进一步深入的研究。综上所述,本论文首先从经典的细胞质miRNA转录后调控靶基因的作用方式入手,研究了 miR-214在细胞凋亡中的作用;其次发现细胞核特异的miR-709能够在转录后水平调节miR-15a/16-1的生成,并通过miR-16/Bcl2通路参与细胞凋亡的调控,扩大了 miRNAs的功能;进一步研究我们还发现miRNAs还存在于线粒体中并具有介导线粒体功能的潜能;同时我们发现细胞和组织外的循环系统血清中的miRNAs能够作为潜在的HBV和HBV-HCC诊断标志物;最后我们找到了主要存在于MV中的血清miRNAs稳定的机制。总之,我们通过方方面面的研究,将miRNA放在细胞质、细胞核、线粒体、细胞外的循环系统中观察规律,发现miRNA在细胞的不同层面上都与凋亡、代谢等重要的生理功能相关,并具有重大的临床应用价值。