肠出血型大肠埃希菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC）O157:H7是一种人类肠道病原菌,致病性强,可引起严重的出血性结肠炎、腹泻和溶血性尿毒综合症。1982年,O157:H7首次被发现,此后,在世界各地时有暴发,对人类健康和公共卫生造成极大威胁。EspF蛋白是EHEC最重要的毒力蛋白之一,它通过三型分泌系统进入肠上皮细胞内,靶向结合细胞线粒体和核仁,破坏肠上皮细胞紧密连接、导致肠上皮细胞微绒毛消失、细胞骨架重排、线粒体机能失调、细胞凋亡等,引起严重的出血性肠炎和腹泻,是大肠杆菌O157:H7感染与致病的一个多功能蛋白。EspF蛋白可与SNX9、N-WASP蛋白相互作用,促进病原菌在宿主肠上皮细胞定植;与 cytokeratin 18、actin、14-3-3 ζ、Arp2/3、profilin、ZO-1 蛋白相互作用,导致肌动蛋白重排;与Abcf2蛋白相互作用,导致细胞凋亡。EspF蛋白与上述宿主蛋白互作的分子基础和分子机制不甚清楚,EspF蛋白还与哪些宿主蛋白互作及其互作机制还需进一步研究。鉴于此,本文采用双分子荧光互补技术、流式分选、荧光能量共振转移（Fret）、免疫印记（WB）等方法,筛选EspF蛋白互作宿主蛋白,研究EspF蛋白与宿主蛋白互作在EHEC致病中的作用机制,得到如下结果:（1）EspF蛋白N端可靶向结合宿主细胞线粒体。分别将espF基因及其N端、C端核苷酸序列克隆到真核表达载体pEGFP-N1,转染细胞后共聚焦显微镜观察,发现EspF蛋白及其N端出现线粒体共定位现象,呈点状分布,而C端定位在细胞质和细胞核,体外表达实验表明EspF蛋白仍靶向定位线粒体,N端具有靶向结合线粒体功能。（2）EspF蛋白可与宿主细胞7个蛋白相互作用。采用双分子荧光互补技术,将目的EspF蛋白连接到黄色荧光蛋白（YFP）N端,构建诱饵质粒慢病毒表达载体,文库质粒与YFP的C端相连,将文库质粒与诱饵质粒共转染后通过流式分选筛选活细胞内有相互作用的蛋白对,提取阳性细胞RNA,反转录成cDNA,经高通量测序分析,确立293个与EHEC O157:H7 EspF蛋白有相互作用的宿主蛋白;生物信息分析发现,这些蛋白共涉及到109条信号通路,其中富集显著的有趋化因子信号通路（p=0.005）、剪接体信号通路（p=0.033）、核糖体信号通路（p=0.035）;选取12个蛋白运用免疫沉淀方法进行互作验证,得到7个宿主蛋白与EspF蛋白互作,结果显示SNX9蛋白、Anxa6蛋白与EspF蛋白互作呈强阳性,PIGC、TMEM176A、GIMAP2蛋白呈现中等阳性,CAPN11、PDHB蛋白呈现弱阳性。（3）CO-IP和Fret技术确证EspF蛋白与Anxa6蛋白互作。分别构建真核表达载体pECFP-EspF-Flag和pEYFP-Anxa6-HA,共转染细胞后,运用Fret技术检测其在细胞内的相互作用,发现Fret效率为74.3%,与阳性对照组（56.0%）相比有统计学差异;提取细胞蛋白进行免疫共沉淀,结果显示,EspF蛋白与Anxa6蛋白形成蛋白复合物被拉下来,进一步体外确证EspF蛋白与Anxa6蛋白相互作用。（4）EspF蛋白与Anxa6蛋白互作可破坏宿主细胞紧密连接。比较pEGFP-EspF和pEYFP-Anxa6转染CaCO2细胞后紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白水平的改变,WB结果表明EspF蛋白和Anxa6蛋白均可导致ZO-1、Occludin蛋白表达水平下降;免疫荧光结果显示EspF蛋白和Anxa6蛋白均可破坏紧密连接结构,使其由原来的完整、连续结构变为松散、不连续,甚至出现裂隙样表现;Anxa6蛋白还可以导致PKCα蛋白的磷酸化。（5）EspF蛋白与Anxa6蛋白互作可能介导抗吞噬作用。将野生株WT、espF基因缺失株ΔespF和espF基因缺失回补株p-ΔespF分别感染小鼠巨噬细胞,细菌存活率结果显示,ΔespF组（45%）和WT组（77%）相比存活率有统计学差异,表明espF基因缺失导致细菌抗吞噬能力降低,初步明确EspF蛋白具有抗吞噬作用,并且可能是通过Anxa6蛋白来介导,本文将进一步研究。结论:本文运用双分子荧光互补技术和流式分选技术,筛选了 EHEC O157:H7 EspF蛋白互作宿主蛋白,得到了 293个互作宿主蛋白列表,验证了 7个宿主蛋白与EspF蛋白互作,明确了 EspF蛋白与宿主Anxa6蛋白相互作用,揭示了它们的互作可破坏宿主细胞紧密连接;并通过撰写综述系统阐述了 EspF蛋白与宿主蛋白互作在EHEC致病中的作用机制。以上结果对进一步阐明大肠杆菌O157:H7感染导致出血性肠炎、腹泻等致病分子机制,揭示病原菌与宿主的相互作用具有重要科学意义。