IFN-γ是II型干扰素家族的唯一成员,主要由受到病原微生物或干扰素诱导剂刺激的Th1淋巴细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生。IFN-γ具有抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节功能,是一种能够刺激机体产生炎症反应的免疫调节因子。目前人类临床上,IFN-γ主要用于慢性淋巴肉芽肿,风湿性关节炎、过敏性皮炎及肾脏肿瘤。尽管IFN-γ具备多种生物功能,但其半衰期短副作用大等问题一直限制着它的应用范围。干扰素在兽医临床上的使用较少,虽然有少量产品上市多为原核表达产物,生物活性较低,治疗效果不佳。血清白蛋白融合技术是目前长效药物研发中较为成熟的手段之一,该方法具有操作较为简单且成本较低的优势。杆状病毒表达系统安全性好、蛋白表达量高、生物活性好、能够同时表达多个基因重组蛋白;且Sf9细胞本身以分泌形式表达细胞外的代谢蛋白量较少,利用杆状病毒系统进行外源分泌型蛋白的表达还具易于纯化的优点。所以本研究采用杆状病毒表达系统对犬血清白蛋白融合干扰素γ进行了表达,以此为基础进一步探索利用白蛋白融合技术制备新型IFN-γ长效制剂的可行性,具体研究如下:首先采用特异性引物对犬血清白蛋白基因及犬干扰素γ基因进行特异性扩增。采用重叠PCR技术,引入柔性连接桥序列GS（GGGGS）2GS对犬血清白蛋白基因及犬干扰素γ基因进行融合,获得融合基因CSA-IFN-γ和IFN-γ-CSA,再将融合基因插入pFastBac I质粒中构建转移载体pFastBac-CSA-γ与pFastBac-γ-CSA。通过蓝白斑筛选,获得重组杆粒Bacmid-CSA-IFN-γ和Bacmid-IFN-γ-CSA。将其转染至Sf9细胞后筛选出能够稳定表达融合蛋白CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的重组杆状病毒。继病毒纯化、PFU测定及蛋白表达情况监测等一系列试验后确定了最佳接毒剂量以及重组蛋白收获时间,利用离子交换层析的方法获得了纯化的CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的融合蛋白。基于IFN-γ的生物活性特点,利用体外实验对犬血清白蛋白融合干扰素γ的活性进行了初步测定。结果显示,与犬重组干扰素γ（reIFN-γ）相比,融合干扰素CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA均能够促使STAT1蛋白发生磷酸化,初步证明采用血清白蛋白融合的方法对犬IFN-γ进行修饰不会导致其丧失生物活性。用MDCK-VSV系统对融合干扰素的抗病毒活性进行了测定,CSA-IFN-γ的效价为3.3×104 U/mg、IFN-γ-CSA的效价为9.7×104 U/mg,融合干扰素抗病毒活性略低于reIFN-γ（1.36×105 U/mg）。DH82肿瘤细胞体外生长抑制实验结果显示CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA对肿瘤细胞具有抑制生长活性但略低于reIFN-γ,CSA-IFN-γ的IC50值为106.91 ng/mL、IFN-γ-CSA为39.84ng/mL、reIFN-γ为18.16 ng/mL。同时对干扰素处理后的DH82细胞形态进行观察,处理72 h后,细胞折光性发生改变、拉丝明显、个别细胞萎缩严重,且有大量死细胞悬浮于培养基中,初步判定融合干扰素可能诱发了DH82肿瘤细胞的凋亡。进而对融合干扰素CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的促凋亡作用进行验证,结果显示在10倍于reIFN-γ的剂量对DH82细胞进行处理后,72 h后可明显的检测到CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的促凋亡作用,且与reIFN-γ的促凋亡程度基本一致。同时对处理后的细胞周期进行了验证,48 h后,可明显检测到IFN-γ-CSA及reIFN-γ使DH82细胞阻滞于G0/G1期,CSA-IFN-γ处理组阻滞效果不明显;在处理后72 h,组间差异基本消失,CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA与reIFN-γ使DH82细胞阻滞于G0/G1期。Wistar大鼠体内药代动力学检测结果显示,与reIFN-γ（2.22 h）相比融合干扰素的半衰期有所提高,C-端修饰产物IFN-γ-CSA的半衰期为6.51 h,仅延长了约2倍,N-端修饰产物CSA-IFN-γ的半衰期为21.73 h,明显高于reIFN-γ及IFN-γ-CSA,表明在N-端对犬IFN-γ进行修饰可显著提高其药物半衰期。为进一步了解融合干扰素γ的治疗作用,用犬肾移植瘤模型检测了融合干扰素γ的体内抗肿瘤活性,结果显示CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA和reIFN-γ均能抑制DH82肿瘤细胞的生长,CSA-IFN-γ的肿瘤抑制效果要明显优于IFN-γ-CSA和reIFN-γ。综合分析融合干扰素体内外生物活性检测结果,发现利用血清白蛋白对犬IFN-γ进行修饰不会导致其生物活性的丧失,且N-端修饰能够显著提高犬IFN-γ的半衰期,更重要得是提高了犬IFN-γ在动物体内的抗肿瘤能力。所以本研究利用血清白蛋白修饰技术能够平衡犬干扰素γ在药代动力学和药效学之间的关系,此方法为开发新型犬类专用的细胞因子类药物奠定了基础。