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【研究背景】 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一大类主要以肺动脉压力和肺血管阻力增高为临床特点的病理生理综合征。其发病的主要病理机制,早期以肺动脉痉挛收缩为主,后期则出现肺动脉内、中、外膜增殖肥厚,导致管腔狭窄为主的血管重塑,整个病理过程伴或不伴有血管内原位血栓形成。肺动脉壁各层,尤其是肺动脉中层出现平滑肌增殖肥厚,以及原先本无平滑肌层的微动脉出现平滑肌肌化,并最终导致官腔狭窄,是肺动脉高压形成过程中最主要的病理表现。深入研究肺小动脉及微动脉平滑肌增殖肥厚的内在机制,进而开发可以阻断或者逆转此过程药物,必将对肺动脉高压的防治起到积极的推动作用。研究表明活性氧(reactive oxygen species,ROS)在慢性低氧性肺动脉高压(chronic hypoxic pulmonary hypertension,CHPH)的肺血管增殖和重塑过程中起着重要作用。而在肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中,ROS主要是由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(oxidase)4(NOX4)通过生物细胞膜传递电子产生。近年研究发现,作为转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员的骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)低浓度时可以促进大鼠PASMCs增殖,而在某些诱导因素存在条件下还可以抑制PASMCs凋亡,BMP4在CHPH血管重塑发生发展过程中起着重要作用。我们的研究发现,在CHPH中BMP4通过上调大鼠肺动脉和PASMCs内经典瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical channel,TRPC)蛋白1、6(TRPC1、TRPC6)的表达,使PASMCs内基础钙离子浓度([Ca2+]i)和钙池操纵性钙内流(store operated calcium entry,SOCE)增加,继而导致肺微小动脉痉挛收缩和重塑,最终使肺动脉阻力和肺动脉压增高。但BMP4如何诱导TRPC的表达,继而导致肺血管重塑的机制仍然不明。最近的研究证实在PASMCs中TGF-β诱导的NOX4表达和ROS生成与增殖明显相关。BMP4是否通过上调大鼠PASMCs NOX4表达,从而影响ROS生成,并进一步调控细胞内钙稳态和肺血管重塑,参与肺动脉高压的形成,有关研究未见报道。 【研究目的】 本实验建立了大鼠远端PASMCs原代培养模型,观察重组BMP4蛋白对BMP4基因敲除小鼠PASMCs中NOX4蛋白和的ROS水平影响;观察BMP4基因敲除小鼠肺动脉平滑肌组织中NOX4蛋白表达情况;构建NOX4基因沉默序列,观察BMP4是否通过NOX4对PASMCs中ROS水平起的作用;观察重组BMP4蛋白对PASMCs的增殖和TRPC1,6的表达的影响;从而探讨BMP4调节PASMCs中钙稳态和肺血管重塑的机制,为防治肺动脉高压寻找有效靶点。 【研究方法】 本文主要采用原代细胞培养技术并辅以转基因小鼠动物实验。 (1)分离大鼠和BMP4基因敲除小鼠肺动脉平滑肌组织,培养原代大鼠远端PASMCs;观察细胞形态及荧光共聚焦α-actin染色鉴定大鼠肺动脉平滑肌细胞;Genotyping鉴定BMP4基因敲除杂合子和野生型小鼠;Western blotting(蛋白质免疫印迹)检测PASMCs和肺动脉平滑肌组织NOX4蛋白;构建NOX4siRNA,细胞转染后Western blotting检测其效率;流式细胞术检测大鼠肺动脉平滑肌细胞内ROS水平。 (2)MTT法检测沉默NOX4基因后大鼠远端PASMCs增殖;Western blotting检测NOX4基因沉默后TRPC1,6蛋白表达。 【实验结果】 1、构建了原代大鼠远端PASMCs细胞模型,大鼠远端PASMCs无论在形态学还是免疫学上都表现出典型的特征,且生理功能良好;成功建立BMP4基因敲除杂合子小鼠;体内外实验证实BMP4可诱导大鼠远端PASMCs及肺动脉平滑肌组织中NOX4蛋白表达;重组BMP4蛋白上调大鼠远端PASMCs ROS平均水平;成功构建NOX4siRNA,转染NOX4siRNA后大鼠远端PASMCs NOX4蛋白低表达;重组BMP4蛋白不能上调NOX4敲除后大鼠远端PASMCs中ROS平均水平。 2、NOX4阻断BMP4诱导的大鼠远端PASMCs中TRPC1的上调;NOX4阻断BMP4诱导的大鼠远端PASMCs中TRPC6的上调;NOX4阻断BMP4诱导的大鼠远端PASMCs细胞增殖。 【实验结论】 1.BMP4上调大鼠远端肺动脉平滑肌细胞中NOX4蛋白的表达和ROS水平。 2.BMP4上调大鼠远端肺动脉平滑肌细胞ROS水平是通过NOX4介导的。 3.BMP4通过NOX4介导促进大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的增殖。 4.NOX4介导BMP4诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内TRPC1,6的表达。