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CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达目的CRT(Calreticulin,钙网织蛋白),能直接通过特异性抑制血管内皮细胞增殖抗肿瘤,并且能够通过增强肿瘤特异性抗原的运输处理抗肿瘤;MAGE-A3(Melanoma antigen gene-A3,黑色素瘤基因-A3),是MAGE家族成员之一,广泛表达于多种恶性肿瘤,但在除胎盘及睾丸外的正常组织中不表达,可被CTL识别而被广泛作为肿瘤治疗的抗原基因。本研究旨在构建CRT/MAGE-A3双基因修饰腺病毒载体,结合抗原特异性肿瘤免疫治疗及抑制肿瘤血管生成治疗两种抗肿瘤机制,为下一步细胞实验及动物实验研究提供基础。方法1、NheI+PmeI酶切重组穿梭载体pShuttle-GFP-CMV,XbaI+PmeI酶切原始质粒pcDNA3-CRT获得目的片段CRT,用T4 DNA连接酶连接构建pShuttle-(△GFP)-CRT,卡那抗性筛选并回收鉴定;2、BglII+XhoI酶切pShuttle-(△GFP)-CRT,Touch Down RT-PCR法从人肺癌组织获得目的片段MAGE-A3,BglII+XhoI酶切处理,用T4 DNA连接酶连接构建pShuttle-CRT/MAGE-A3,卡那抗性筛选并回收鉴定;3、I-CeuI+I-SceI酶切处理pAdxsi载体后乙醇沉淀法回收,I-CeuI+I-SceI酶切处理穿梭载体pShuttle-CRT/MAGE-A3,用T4 DNA连接酶连接构建Ad-CRT/MAGE-A3,氨苄抗性筛选并提取鉴定;4、鉴定正确的腺病毒载体经PacI限制性内切酶线性化后转染293LP细胞扩增、纯化及滴度测定;5、用Westernblot法检测转染后293LP细胞中CRT和MAGE-A3蛋白的表达。结果1、重组穿梭载体pShuttle-(△GFP)-CRT经HindⅢ酶切鉴定显示连接成功;2、重组穿梭载体pShuttle-CRT/MAGE-A3经BglII+XhoI酶切鉴定显示连接成功;3、重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3经XhoI酶切鉴定显示连接成功;4、扩增纯化后测定病毒滴度为2×10~7PFU/μl;5、纯化后的腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3与对照的空Ad载体转染人胚肾细胞293 LP 24 h后,Western blot结果显示CRT和MAGE-A3表达。结论成功构建了pAdxsi-CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体,并检测出CRT基因及MAGE-A3基因的蛋白在293 LP细胞中表达。