【摘 要】
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在胚胎性腺中,支持细胞是最先进行分化的体细胞,其对公猪生精过程及睾丸发育具有重要作用。公猪产生精子的能力受到成熟支持细胞数量的限制,而成熟支持细胞的数量是由未成熟支持细胞的增殖活力决定的。已有部分研究表明环状RNA对支持细胞增殖或凋亡有关键调控作用,然而目前鉴定出的大部分环状RNA其功能仍是未知的。本研究鉴定了circ01801的环状结构,检测其在不同时期梅山、杜洛克与大白公猪睾丸中的表达水平,利
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在胚胎性腺中,支持细胞是最先进行分化的体细胞,其对公猪生精过程及睾丸发育具有重要作用。公猪产生精子的能力受到成熟支持细胞数量的限制,而成熟支持细胞的数量是由未成熟支持细胞的增殖活力决定的。已有部分研究表明环状RNA对支持细胞增殖或凋亡有关键调控作用,然而目前鉴定出的大部分环状RNA其功能仍是未知的。本研究鉴定了circ01801的环状结构,检测其在不同时期梅山、杜洛克与大白公猪睾丸中的表达水平,利用Edu、CCK-8及流式细胞术探究其在支持细胞中的功能,并通过qPCR、Western blot双荧光素酶报告系统等方法寻找circ01801参与的调控机制,主要结果如下:1.睾丸全转录组测序结果显示circ01801在210日龄杜洛克公猪与大白猪睾丸中差异表达,通过qPCR验证了测序数据并发现circ01801在支持细胞中的表达显著高于在间质细胞中的表达,随后通过核质分离技术发现该circRNA主要定位于支持细胞的细胞质。2.利用发散引物、收敛引物扩增以及桑格测序鉴定了circ01801的反向剪接位点,随后通过RNase R酶耐受性试验进一步确认其具有环状结构。3.利用qPCR、Western blot、Edu、CCK-8及流式细胞术检测过表达和干涉circ01801对支持细胞增殖以及周期的影响,结果显示circ01801能够促进细胞增殖并加速支持细胞的周期进程。4.通过双荧光素酶检测系统证实circ01801能够与miR-30a-3p在支持细胞中结合。利用qPCR、Western blot、Edu、CCK-8及流式细胞术发现miR-30a-3p能够抑制支持细胞增殖与周期进程。5.通过双荧光素酶检测系统确定miR-30a-3p可结合ATP1A1基因3＇UTR区域。利用qPCR、Western blot检测发现miR-30a-3p负调控ATP1A1的表达,而circ01801通过吸附miR-30a-3p正调控靶基因ATP1A1的表达。综上所述,miR-30a-3p能够靶向ATP1A1基因抑制支持细胞增殖,同时circ01801在支持细胞中能结合miR-30a-3p并上调靶基因ATP1A1的表达从而促进支持细胞增殖,为解析公猪生精过程及睾丸发育机制奠定基础。
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