肿瘤干细胞在癌症中扮演了一个重要角色，因为这些细胞具有增强的形成肿瘤的能力并且对现有的抗癌治疗存在抵抗作用。因此，必须找到新癌症治疗方法既能消退肿瘤又能针对肿瘤干细胞从而达到彻底关闭肿瘤细胞的目的。　　 过去数年里对溶瘤病毒治疗恶性肿瘤的研究越来越多。溶瘤病毒能在易感的肿瘤细胞内增殖，能在肿瘤内或者转移灶内瞄准、感染并且毁灭残留的肿瘤细胞，这个过程能自行重复直到被宿主的抗病毒应答反应清除病毒。许多研究显示呼肠孤病毒3型对人类不致病而且导致人肿瘤细胞的死亡，本课题研究呼肠孤病毒对乳腺癌干细胞的治疗作用。　　 一、NOD/SCID鼠异种原位移植乳腺癌模型的建立　　 目的：建立NOD/SCID鼠异种原位移植乳腺癌模型并鉴定其生物学特性是否与原发肿瘤一致。　　 方法：采用手术中获得的ER强阳性的乳腺癌患者的肿瘤组织块移植到NOD/SCID鼠的乳房脂肪垫上。经过3次筛选传代，移植模型趋于稳定并进行鉴定。通过HE、TUNEL、DCC和免疫组化等方法，分析乳腺癌异种移植模型的生物学特性。　　 结果：建立ER阳性的人乳腺癌异种移植NOD/SCID鼠模型必须有雌激素辅助。在雌激素辅助下移植成功率可以达到29.6％，没有雌激素辅助的肿瘤不能成活(P<0.01)。免疫组化和DCC测定提示移植瘤模型的ER均为阳性。HE、TUNEL等提示模型保持了原移植物的生物学特性。　　 结论：NOD/SCID鼠乳腺癌模型传代稳定，符合建立模型的筛选标准，同时保持了原发癌的生物学特性，表明模型鼠成功建立。　　 二、乳腺癌干细胞的富集和微球体形成的影响因素　　 目的：探讨MCF-7细胞、BT474细胞和MDA-MB-231细胞微球体形成的影响因素，并检测其CD44+CD24-/low的表达比例，明确富集干细胞的方法，以获得稳定数量的干细胞。　　 方法：将MCF-7、BT474和MDA-MB-231乳腺癌细胞进行微球体培养，取培养第7天的微球体细胞分别进行干细胞表型的FCM检测分析，判断干细胞富集的程度。　　 结果：MCF-7、BT474和MDA-MB-231细胞形成微球体的效率分别为2.4％±0.2％、1.6％±0.1％和0.6％±0.05％。在通常的干细胞培养液中MDA-MB-231细胞很难聚团生长。但是如果去除胰岛素，MDA-MB-231细胞则聚团生长。单层培养细胞中MCF-7、BT474和MDA-MB-231的CD44+CD24-/low的比例为10％±0.2％、0.3％±0.05％和37％±1.8％，微球体细胞中CD44+CD24-/low的比例分别为8.1％±0.4％、0.6％±0.2％和93.8％±2.1％，乳腺癌细胞中表达CD44+CD24-/low细胞表型的比例明显低于同种细胞培养的微球体(p<0.01)。　　 结论：通过微球体培养，富集了肿瘤干细胞，但是不同乳腺癌细胞来源的微球体中干细胞所占的比例差异很大，MDA-MB-231细胞最高。　　 三、溶瘤病毒呼肠孤病毒3型的扩增鉴定　　 目的：扩增呼肠孤病毒并且进行特异性鉴定和活力测定。　　 方法：在LLC-MK2细胞中培养扩增病毒，首先通过特征性致细胞病变如细胞聚团和脱落鉴定病毒，通过Real-Time PCR(RT-PCR)鉴定病毒的纯度。用TCID50进行病毒活力测定。　　 结果：从特征性致细胞病变看LLC-MK2细胞对呼肠孤病毒非常敏感。从上清获得的病毒的特异性得到RT-PCR确认，活力测定显示上清中呼肠孤病毒的溶度为107.33 TCID50/ml，活性很高。　　 结论：呼肠孤病毒能够通过LLC-MK2细胞培养进行扩增并纯化，而且这种方法有利于保存病毒并且有利于对其结构和特性进行持续研究。　　 四、呼肠孤病毒对乳腺癌干细胞的治疗作用　　 目的：探讨呼肠孤病毒在体外对乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞的治疗作用，在体内对乳腺癌实体瘤的治疗作用和对其他重要脏器的影响。　　 方法：比较呼肠孤病毒和表阿霉素作用下MCF-7、BT474细胞及其微球体中干细胞表型CD44+CD24-/low的表达变化(FCM法)以及细胞凋亡的变化(TUNEL法)，研究呼肠孤病毒对乳腺癌干细胞的治疗作用。呼肠孤病毒感染人乳腺癌原位移植NOD/SCID鼠模型，通过TUNEL和HE研究该病毒在体内对肿瘤和其他重要脏器的影响。　　 结果：在表阿霉素作用下MCF-7和BT474微球体细胞中表达CD44+CD24-/low比例明显升高，为18％±4.5％和0.9％±0.13％(P<0.01)。病毒感染后MCF-7和BT474微球体细胞中表达CD44+CD24-/low比例明显下降，分别为0.8％±0.2％和0.2%±0.1％(P<0.05)。BT474和MCF-7微球体在应用病毒以后凋亡率上升明显，MCF-7的凋亡率从1.9％±0.21％上升至5％±1.4％，BT474的凋亡率从0.2％±0.1％上升至1％±0.16％(P<0.05)。此外，病毒作用于NOD/SCID鼠乳腺癌动物模型，可致肿瘤细胞大量裂解消失，凋亡增加，同时对肺有损伤。　　 结论：表阿霉素对微球体细胞的细胞毒作用较低，并可用于富集乳腺癌干细胞。呼肠孤病毒对BCSCs和癌症细胞同时具有治疗作用，病毒还能够促进乳腺癌干细胞的凋亡，有可能达到关闭癌细胞的目的。病毒的生物学安全有待进一步研究。