“治肺”、“治肠”、“肺肠合治法”对肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠Th17/Treg平衡机制影响的比较研究

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目的:本研究基于“肺与大肠相表里”相关脏腑理论,建立“肺肠合病”模型即肠道菌群失调合并过敏性哮喘动物模型,结合Thl7/Treg平衡机制在哮喘发生发展中至关重要的作用,对比治肺、治肠、肺肠合治三种治法对肠道菌群失调合并过敏性哮喘的治疗效应、以及对Thl7/Treg平衡机制调节作用,这将进一步丰富“肺与大肠相表里”脏腑相关理论的科学内涵,亦为临床中医防治过敏性哮喘提供理论借鉴和思路参考,以期提高临床疗效。方法:选用SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠,按体重进行分层设计随机分组,分为空白组、菌群失调合并哮喘激发组(后简称模型组)、“桂枝加厚朴杏子汤”治疗组(后简称治肺组)、“增液承气汤”治疗组(后简称治肠组)、“升降散”治疗组(后简称肺肠合治组),共五组。依据文献改良后建立肠道菌群失调合并过敏性哮喘模型。造模后,从激发当天三个治疗组分别给予桂枝加厚朴杏子汤、增液承气汤、升降散浓缩液灌胃,空白组和模型组灌生理盐水,连续7天。实验过程中观察大鼠的一般情况(在外观、反应、毛色、纳食、粪便情况等),哮喘症状(烦躁、打喷嚏、咳嗽、腹肌强烈收缩、呼吸急促等);造模及治疗结束后使用生物机能实验系统检测大鼠肺功能,取肺组织、肠组织、支气管肺泡灌洗液、结肠中的新鲜粪便等,采用培养法分析粪便菌群,运用Q-PCR检测肺组织Foxp3 mRNA及ROR-γ tmRNA的表达,利用ELISA检测血清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-17含量及BALF中sIgA、IL-4细胞因子浓度,以及肠黏膜的sIgA含量。结果:1、大鼠一般情况:模型组、治肺组、治肠组、肺肠合治组的大鼠在雾化过程中均出现不同程度的烦躁不安或者安静少动、呼吸频率加快加深、点头样呼吸、弓背直立、前肢缩抬,二便失禁等哮喘速发相反应表现;正常组大鼠则活动自如,无上述表现;除空白组外,模型组、治肺组、治肠组、肺肠合治组均不同程度出现懒动、少食,倦怠蜷缩,被毛蓬松无泽,反应迟缓,体重减轻,摄食量减少,大便次数增多或减少,便质稀溏,偶有便秘或排便困难。2、肺组织及肠组织形态学结果:与空白组比较,模型组肺组织血管壁周围及肺间质炎性细胞浸润严重,经过治疗后,病损情况有不同程度的改变,其中以治肠组的肺组织改善最为显著,其次为肺肠合治组;而模型组的结肠组织较空白组肌层、浆膜层炎细胞浸润均不同程度损害,治疗3组对结肠组织病损有所改善,其中治肺组比病理模型组浸润程度减轻最为显著,其次则为肺肠合治组。3、肺部支气管炎症变化:治肺组中BALF中白细胞总数和EOS百分比显著降低,EOS虽也有降低趋势,但不具有显著性差异;BALF中IL-4显著降低。治肠组中BALF中EOS和EOS百分比明显降低,具有显著性差异,白细胞总数有降低趋势,但不具统计学差异;BALF中IL-4显著降低。肺肠合治组中BALF中白细胞总数和EOS含量显著降低,EOS百分比虽也有降低趋势,但不具有显著性差异;BALF中IL-4显著降低。4、肺功能变化:治肺组哮喘大鼠的呼吸频率明显低于模型组,更接近于空白组水平,具有统计学意义。气道高反应性虽低于模型组,但不具有统计学差异。治肠组哮喘大鼠的呼吸频率和气道高反应性均明显低于模型组,具有统计学意义。,肺肠合治组哮喘大鼠的呼吸频率和气道高反应性均明显低于模型组,具有统计学意义。5、肠道菌群变化:治肺组中大肠杆菌的数量较模型组明显降低,使之更趋向于空白组水平,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均显著升高,白色念珠菌显著减少,均具有统计学差异。肠球菌较模型组减少,但不具有统计学意义。治肠组中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均显著升高,白色念珠菌显著减少,均具有统计学差异。肠球菌和大肠杆菌较模型组变化不大,不具有统计学意义。肺肠合治组中大肠杆菌的数量较模型组明显降低,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均显著升高,白色念珠菌显著减少,均具有统计学差异。肠球菌较模型组有减少趋势,但不具有统计学意义。6、肠粘膜sIgA变化:治肺组较模型组sIgA呈增加趋势,但无统计学意义。治肠组较模型组sIgA呈显著性增加,有统计学意义。肺肠合治组较模型组sIgA显著增加,具有统计学意义。7、血清中IL-4、IL-6、IL-I0、IL-17含量的变化:治肺、治肠、肺肠合治组均显著升高了血清中IL-I0的水平,以治肠组最为明显;治肺、肺肠合治组均降低了血清中IL-17的水平,以治肺组更明显,治肠组虽表现出对血清中IL-17的水平有降低趋势,但无统计学意义;治肺、治肠、肺肠合治组均降低了血清中IL-6的水平,以治肠组较为明显。治肺、治肠、肺肠合治组均不同程度升高了血清中TGF-β的水平,以治肺组升高最明显,肺肠合治组升高最不明显。8、PCR法检测肺组织FoxP3mRNA、RORγ tmRNA表达的变化:治肺、治肠、肺肠合治组均表现出FoxP3mRNA水平的升高和RORy tmRNA水平的降低,FoxP3mRNA水平的升高以肺肠合治组最为明显,R ORy tmRNA水平的降低以治肺组最为明显。结论:1、治肺、治肠、肺肠合治三种治法对肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠均表现出治疗作用。治肺法代表方“桂枝加厚朴杏子汤”能显著改善模型大鼠肠道菌群变化。治肠法代表方“增液承气汤”能显著改善肺部炎症和肺功能状况。肺肠合治法能同时改善肺部炎症、肺功能、肠道菌群和肠粘膜sIgA的水平变化。本结论体现了“治肺法可以治肠”、“治肠法可以治肺”、“肺肠合治法可以肺肠同治”,这与“肺与大肠相表里”脏腑理论的“肺病治肠”、“肠病治肺”、“肺肠合病则肺肠合治”是相吻合的。2、治肺、治肠、肺肠合治三种治法对肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠Thl7/Treg平衡机制相关细胞因子和基因均表现出良性调节作用。但三种治法的作用机制各不相同。其中治肠法可能升高了血清中IL-I0水平、降低血清中IL-6水平而起到良性调节Th17/Treg平衡机制的效应;治肺法可能通过降低血清中IL-17水平、升高血清中TGF-β水平和降低肺组织RORy tmRNA水平而起到良性调节Th17/Treg平衡机制的效应;肺肠合治组可能通过升高肺组织FoxP3mRNA表达的水平而起到良性调节Th17/Treg平衡机制的效应。3、本研究进一步丰富了“肺与大肠相表里”脏腑相关理论的科学内涵,论证了肺与肠在生理、病理状态下的相关性和传变性。在临床治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘时,对肺部炎症和肺功能差较显著者宜选用或加用治肠法;对肠道菌群失调较严重者宜选用或加用治肺法治疗;对同时出现肺部炎症、肺功能差、肠道菌群失调和肠道免疫力降低较显著者宜选用肺肠合治法治疗。
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